阿拉伯半乳聚糖吸附阿魏酸的特性研究

朱建飛,唐敏,高瑞萍,2,常海軍,2

1(重慶工商大學 環(huán)境與資源學院，重慶, 400067)2(重慶市特色農(nóng)產(chǎn)品加工儲運工程技術研究中心，重慶, 400067)

近年來，有關生物大分子與小分子相互作用的研究報道越來越多，特別是關于蛋白質(包括酶)和DNA與活性小分子相互作用的研究逐漸成熟[1-3]。但是關于多糖與活性小分子相互作用的研究內(nèi)容卻不多。阿拉伯半乳聚糖(arabinogalactan, AG)是阿拉伯糖和半乳糖組成的中性多糖，在醫(yī)藥、食品、化妝品中應用廣泛。美國食品藥品管理局已經(jīng)批準AG可以作為食品添加劑使用。AG的吸水性很強，添加到食品中可以形成一種膠凝體，增加食品的體積，改善食品的軟度和口感[4]。阿魏酸(ferulic acid, FA)是酚酸的一種，廣泛存在于植物中，是阿魏、當歸、川芎、升麻等中藥材的有效成分，在醫(yī)藥、化妝品、保健品、食品中有著廣泛的應用[5-7]。由于FA不穩(wěn)定，它的許多應用都會被限制，通常，F(xiàn)A與多糖結合后可以形成更加穩(wěn)定、更具有靶向活性的復合物，常見于植物細胞壁、烘焙食品、啤酒加工等[8-9]。目前，還未見有AG與FA結合特性研究的文獻報道。本文旨在研究AG與FA結合特性，為該復合物在食品、藥品等方面應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

阿魏酸(純度99%),湖北遠成藥業(yè)有限公司；阿拉伯半乳聚糖(純度>98%),上海伊卡生物技術有限公司；無水乙醇、甲醇(分析純)，成都科龍化工試劑廠；甲酸、Na2HPO4、NaH2PO4、NaHCO3、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)(分析純)，重慶川東化工有限公司；CP214型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；DELTA320-S型PH計，深圳富哲儀器有限公司；RE-52A型旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；T-18型分散機(配S10N 5G型分散頭)，德國IKA公司；UV-2450型紫外可見分光光度計，日本Shimadzu公司；傅立葉變換紅外光譜儀，日本Shimadzu公司；HJ-6A型多頭磁力攪拌器，金壇市科析儀器有限公司；XH-B型漩渦混合器，上海達洛科學儀器有限公司；KS-080型超聲波清洗機，深圳市潔康洗凈電器有限公司；LGJ-18S型冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；MD34型透析袋，北京索萊寶科技有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠。

1.2 檢測方法

1.2.1 FA含量測定

首先采用紫外掃描分析法，于200～400 nm波長內(nèi)對FA的甲醇溶液進行掃描，以確定FA的特征吸收波長。精確稱取2.5 mg FA標品，用甲醇溶解并定容至25 mL，制成100 μg/mL的母液，再分別取該溶液0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 mL，分別定容至25 mL，搖勻。制成的標準溶液質量濃度為2、4、6、8、12、16 μg/mL。采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法檢測FA的含量[6]，流動相：A相： 0.3%(體積分數(shù))甲酸水溶液；B相：0.3%(體積分數(shù))甲酸甲醇溶液，A相與B相體積比為60∶40，流速為0.8 mL/min，進樣量為10 μL，檢測波長322 nm，出峰時間8.1 min。將配制好的梯度FA甲醇溶液按照上述方法測量，記錄所得的峰面積，以FA濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。計算得到阿魏酸標準曲線的回歸方程為Y=77.276X-13.512，R2=0.999 1，式中X為FA濃度，Y為峰面積。

1.3 試驗設計

1.3.1 平衡透析試驗

取長約10 cm的透析袋，用前進行常規(guī)處理，取6 mL質量濃度為0.5 mg/mL的AG溶液和2 mL質量濃度為0.5 mg/mL的FA溶液，放入透析袋中，封好透析袋，將透析袋放入盛有100 mL磷酸緩沖液的燒杯中，將燒杯放在磁力攪拌器上攪拌，每隔1 h用紫外分光光度計測1次透析外液中FA的吸光度，直至吸光度不變時達到透析平衡,以確定吸附時間。

1.3.2 單因素試驗

考察單因素有緩沖液pH、溫度和FA濃度。選取的點分別為緩沖液pH:3、4、5、6、7；溫度：20、30、40、50、60 ℃；FA質量濃度：1、5、9、13、17 mg/mL。分別將盛有6 mL 0.5 mg/mL AG和2 mL不同濃度的FA溶液的透析袋放入盛有 100 mL不同pH濃度為0.5 mol/L的PBS緩沖液中，透析溫度為20～60 ℃，透析平衡后透析袋外液過0.45 μm濾膜后經(jīng)HPLC測定游離FA含量。每個點進行3次平行實驗，根據(jù)FA的標準曲線計算AG對FA的吸附量(Qe，μg/mg)。

1.3.3 Box-Behnken設計試驗

在單因素試驗的基礎上，進行Box-Behnken設計試驗。選取溫度、pH和FA濃度3個因素為自變量(X)，各分3個水平，共15個實驗點，可以分為兩類，一類是析因點，自變量取值在X1、X2、X3所構成的三維頂點，共有12個析因點；另一類是零點，為區(qū)域的中心點，零點實驗重復3次，用以評估試驗的誤差。以AG對FA的吸附量(Qe)為響應值(Y)，運用Design-Expert 8.0軟件設計響應面實驗并對實驗結果進行回歸分析，通過響應面分析對試驗條件進行優(yōu)化，Box-Behnken設計試驗因素水平取值及編碼表見表1。

表1 Box-Behnken設計試驗因素和水平Table 1 The factors and levels of Box-Behnken design

1.3.4 AG - FA復合物的制備

取60 mL質量濃度為0.5 mg/mL的AG溶液和20 mL質量濃度為0.5 mg/mL的FA溶液于透析袋中，將透析袋放入盛有100 mL的磷酸緩沖液的燒杯中透析一定時間，透析平衡時取出透析袋，流水透析24 h，去除大部分雜質，再用蒸餾水透析，每2～3 h更換1次蒸餾水，去除小分子雜質。將透析袋內(nèi)液取出，旋轉蒸發(fā)后大大降低透析液的體積，冷凍干燥，制成樣品，密封后置于干燥器中保存。

1.3.5 AG-FA復合物結構表征

(1)紫外分光光譜分析

分別把FA、AG、復合物、物理混合物配成質量濃度同為1 mg/mL的溶液，然后用紫外分光光度計在200～350 nm的波長下掃描得到紫外圖譜。

(2)傅里葉變換紅外光譜分析

分別精確稱取2 mg樣品，樣品分別為FA、AG、復合物、FA和AG質量比為1∶4的物理混合物，其中物理混合物為采用漩渦混合器處理1 min制得。樣品與干燥的KBr以質量比1∶50的比例混合在瑪瑙研缽研磨成均勻細粉，采用專用的壓片設備，制備成薄片[10]。然后分別用傅立葉變換紅外光譜儀對樣品進行紅外掃描。

(3)掃描電子顯微鏡分析

掃描電鏡法是用導電雙面膠將樣品粉末固定在金屬樣品平臺上，在真空中噴涂鉑金后，置于掃描電子顯微鏡中以 3 kV 電子束觀察，拍攝有代表性的樣品顆粒的形貌照片[11]。樣品分別是AG、復合物和物理混合物，拍攝的照片放大倍數(shù)是500和2 000倍放大倍數(shù)。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 平衡透析實驗時間的確定

以透析外液中游離FA的吸光值為縱坐標，吸附時間為橫坐標，做出AG對FA的吸附曲線，如圖1所示，隨著時間的增大，游離FA的濃度逐漸增大，當達到5 h時，F(xiàn)A濃度不再增大，表明AG對FA的吸附在5 h時達到最大。故以下實驗采用5 h的吸附時間。

圖1 時間對透析外液中游離FA濃度的影響Fig.1 Effect of time on the concentration of free FA in dialysate注：標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 pH對吸附量的影響

pH是影響吸附過程的重要影響因素之一。它與吸附劑表面的吸附機制有關，并且反映了吸附劑與吸附之間理化作用的本質[12]。本實驗中FA質量濃度設定為0.5 mg/mL，溫度為25 ℃，pH為3～7，試驗結果如圖2所示。隨著pH增大，AG對FA的吸附量顯著增大，當pH為5時，達到最大吸附量，為81.62 μg/mg。當pH再增大時，吸附量則減小。吸附量隨透析外液pH波動的現(xiàn)象可能是由于阿魏酸是弱有機酸，在水溶液中易受溶液pH值影響而發(fā)生變性、異構化、產(chǎn)生沉淀等。

圖2 透析外液pH對吸附量的影響Fig.2 Effect of pH of dialysate on the adsorption capacity of FA on AG

2.1.3 溫度對吸附量的影響

根據(jù)pH對吸附量的影響結果，將緩沖液的pH設定為5，F(xiàn)A質量濃度為0.5 mg/mL，溫度設定為20～70 ℃。圖3表明了不同溫度對AG對FA吸附的影響結果。由圖3可知，當溫度<50 ℃時，吸附量隨著溫度變化趨勢不明顯，呈現(xiàn)先增大后減小再增大的趨勢，吸附量都在125.60 μg/mg(40 ℃)左右。KAMMERER等[13]也報道了類似的趨勢，他們認為溫度(25、50 ℃)并沒有顯著影響顏料的結合能力。隨著溫度繼續(xù)升高，對FA的吸附量顯著降低，60 ℃時的吸附量為80.12 μg/mg。鑒于以上情況，最終選取40 ℃ 進行下一步實驗。

圖3 不同溫度對吸附量的影響Fig.3 Effect of temperature on the adsorption capacity of FA on AG

2.1.4 FA濃度對吸附量的影響

吸附質濃度對吸附過程影響很大，通常都用作影響吸附量的重要因素之一[14]。由圖4可知，當溫度和緩沖液pH保持不變時，隨著FA濃度的增大，吸附量增加。低質量濃度(<5 mg/mL)時吸附量增加幅度較小，高質量濃度(>5 mg/mL)時吸附量陡增，當FA質量濃度增加到17 mg/mL時，吸附量達到極大值，且此時再增大FA濃度，透析時則容易出現(xiàn)結晶現(xiàn)象。結果表明FA濃度顯著影響AG吸附FA的效果。

圖4 FA濃度對吸附量的影響Fig.4 Effect of the concentration of FA on the adsorption capacity of FA on AG

2.2 響應面優(yōu)化分析

以吸附量為響應值(Y)，采用Design-Expert 8.0 軟件進行響應面回歸擬合分析，得到如表2所示的Box-Behnken試驗設計方案。擬合得到的理化因素與吸附量間的模型公式為：

式中:X1、X2和X3分別為FA質量濃度(mg/mL)、緩沖液pH和溫度(℃)。

表2 Box-Behnken試驗設計結果Table 2 The results of central composite design

對響應面模型進行方差分析，結果見表3，模型達到顯著水平(P<0.05)，失擬項不顯著(P>0.05)，失擬值和純誤差值小，R2=0.913 3，說明方程與實際情況擬合得較好，實驗誤差小，因此可以用該方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。方差分析還表明，一次項中有顯著影響因素，而二次項所有因素影響都不顯著，表明各個試驗因素對響應值的影響是簡單的線性關系。其中FA濃度和溫度對吸附量有極顯著的影響，而pH對其影響則并不明顯。根據(jù)方差分析表中單因素的F值可看出，影響AG吸附FA的因素影響效果按大小排序依次為FA質量濃度(X1)>溫度(X3)>pH(X2)。

表3 方差分析結果Table 3 Analysis of variance

a-FA質量濃度 (X1)和pH(X2)及其相互作用；b-溫度(X3)和FA質量濃度(X1)及其相互作用；c-溫度(X3)和pH(X2)及其相互作用圖5 FA濃度、pH、溫度及其相互作用對AG對FA的吸附能力影響Fig.5 The infuence of FA concentration，pH，temperature and their Interaction

圖5-a、圖5-b、圖5-c分別表示FA質量濃度、pH和溫度及其相互作用對AG對FA的吸附能力影響的響應面?？梢钥闯鯢A濃度、pH和溫度間的交互作用不顯著，其中FA濃度對吸附量的影響最為顯著。根據(jù)Design Expert 8.0軟件最終擬合出的最優(yōu)吸附條件為FA質量濃度15 mg/mL，pH 5.03，溫度20 ℃，計算出的理論吸附量是1 374.25 μg/mg。在優(yōu)化后工藝的條件下進行3次驗證實驗，得到實際吸附量為1 370.17 μg/mg，與模型理論預測值較為接近，說明預測模型比較可靠。

2.3 樣品結構表征

2.3.1 紫外圖譜分析

由圖6可知，F(xiàn)A溶液的圖譜中有3個大的吸收峰，215.5 nm(λ1，芳香環(huán)的雙鍵吸收，π-π* 躍遷產(chǎn)生)，289.5 nm和312 nm(λ2，λ3含n電子的不飽和基團的吸收，n-π* 躍遷產(chǎn)生)[15]，但是與復合物的圖譜對比，復合物的這幾個吸收峰都沒有，雖然AG和復合物在190～350 nm處沒有明顯的吸收峰，但是它們濃度相同時吸光度不同，復合物與物理混合物的圖譜也明顯不同，所以初步判斷AG與FA形成了復合物。

a-FA;b-物理混合物;c-AG;d-復合物圖6 紫外光譜圖Fig.6 Ultraviolet spectrogram of samples注：λ1=215.5 nm, λ2 =289.5 nm, λ3=312 nm

2.3.2 傅里葉變換紅外光譜分析

如圖7所示，AG在3 400 cm-1左右的寬峰是O—H的伸縮振動，是多糖的特征吸收峰[16]，2 924 cm-1處的峰是—CH2的對稱伸縮振動峰。圖7中的c為FA的FT-IR圖譜，與黃自知等[17]的報道完全吻合。比較圖7的b和d可見，AG、FA的化學復合物與其物理混合物的FT-IR圖譜有明顯差異。圖7中的d中物理混合物的圖譜保留了FA的特征吸收峰，而圖7中的b中復合物的很多FA的特征吸收峰消失，推測是由于AG對FA的非共價吸附作用所致。類似的結果在ZHANG等[5]關于菜籽果膠類多糖與阿魏酸非共價相互作用的研究中有報道。

a-AG;b-復合物;c-FA;d- 物理混合物圖7 紅外光譜圖Fig.7 FT-IR spectrogram of samples

2.4 掃描電子顯微鏡結果分析

由圖8明顯可以看出未結合FA的AG顆粒表面比較光滑且體積較大，物理混合物中FA晶體與AG呈分離狀態(tài)，F(xiàn)A與AG之間未結合；而AG與FA復合物表面粗糙，F(xiàn)A晶體嵌入AG內(nèi)，結合比較緊密，未見有游離狀態(tài)的FA晶體,且復合物的顆粒較結合之前的AG小，表明AG與FA結合形成了新物質，形貌特征發(fā)生了變化。

a-AG(放大500倍);b-AG(放大2 000倍);c-復合物(放大500倍);d-復合物(放大2 000倍);e-物理混合物(放大500倍);f-物理混合物(放大2 000倍)圖8 樣品的掃描電子顯微鏡圖Fig.8 Scanning electron microscope of samples

3 結論

(1)通過平衡透析實驗對影響AG吸附FA效果在單因素實驗的基礎上進行Box-Benhnken 設計并進行響應面分析，得到各因素對吸附影響效果的大小順序為FA質量濃度>pH>溫度，優(yōu)化出AG吸附FA的條件：FA質量濃度15 mg/mL、pH 5.03、溫度20 ℃。在此條件下，AG吸附FA的實際值為1 370.17 μg/mg。

(2)紫外和紅外掃描圖表明AG與FA產(chǎn)生了結合作用，生成了新的復合物。掃描電子顯微鏡掃描圖顯示，與各單體、物理混合物相比，AG-FA的形貌特征發(fā)生了改變。

(3)本研究證實AG與FA結合產(chǎn)生了新物質，但兩者之間結合的分子間作用力，復合物的高級結構和溶液性質還需進一步研究。