農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物半纖維素水解糖的分離純化及單糖組成分析

張梅娟，錢朋智，董力青，韓楊，汲廣習(xí)，馮鎮(zhèn)

1(齊齊哈爾龍江阜豐生物科技有限公司，黑龍江 齊齊哈爾，161031)2(齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾，161006)3(齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾，161006)4(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱，150030)

我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品資源豐富，分布廣泛，已形成了不同特色的農(nóng)產(chǎn)品加工產(chǎn)業(yè)，但同時(shí)也產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物，如玉米皮、醋糟、白酒酒糟等，均含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物和其他有效物質(zhì)，主要用于飼料及發(fā)酵行業(yè)[1-10]；但用量有限，總體利用程度低下，產(chǎn)品附加值嚴(yán)重偏低，環(huán)境污染嚴(yán)重，缺少綜合利用模式[11]。因此，變廢為寶、化害為利、保護(hù)環(huán)境、節(jié)約資源，實(shí)現(xiàn)廢棄物資源化利用是當(dāng)今社會(huì)研究的熱點(diǎn)之一[12]。

玉米皮、醋糟、白酒酒糟屬于生物質(zhì)材料，含有豐富的多糖類物質(zhì)半纖維素，其中玉米皮中約占30%～50%[1]，醋糟干固物中約占15%～25%[13]，白酒酒糟中約占10%～12%(主要為多縮戊糖類物質(zhì))[14]。半纖維素是一類復(fù)合聚糖的總稱，包括木聚糖、阿拉伯聚糖、甘露聚糖等[15-16]。相關(guān)研究表明，木聚糖和阿拉伯聚糖等糖作為功能性低聚糖，具有獨(dú)特的生理功能，在食品、飼料和醫(yī)藥方面具有廣泛的用途[17-19]，在營(yíng)養(yǎng)與保健、畜牧養(yǎng)殖、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)及抗病害等方面具有極大的潛力[20]。因此，提取玉米皮、醋糟、白酒酒糟半纖維素中的水解糖(聚糖)具有十分重要的研究意義。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)提取農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物半纖維素中水解糖的研究較多，但多是關(guān)于預(yù)處理工藝和水解工藝的報(bào)道，多數(shù)研究未對(duì)這些獲得的半纖維素水解糖進(jìn)行分離純化。為了更深層次解析這些農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物半纖維素水解糖的組成及性能，對(duì)所得到的半纖維素水解糖進(jìn)行分離純化必不可少。

在實(shí)驗(yàn)室前期研究中已對(duì)玉米皮、醋糟、白酒酒糟半纖維素的水解方法進(jìn)行了優(yōu)化，本研究以這3種副產(chǎn)物為原料，采用優(yōu)化的低濃度硫酸法水解工藝對(duì)其半纖維素進(jìn)行水解，利用活性炭法對(duì)半纖維素水解糖中的色素進(jìn)行脫除，進(jìn)一步應(yīng)用D301弱陰離子交換層析、001×7強(qiáng)陽離子交換層析聯(lián)合D201強(qiáng)陰離子交換層析對(duì)所得水解糖進(jìn)行分離純化，采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)對(duì)所得高純度水解糖單糖組成進(jìn)行測(cè)定。本研究以期為玉米皮、醋糟、白酒酒糟半纖維素水解糖結(jié)構(gòu)解析及功能性產(chǎn)品的研究開發(fā)提供初步理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米皮,齊齊哈爾龍江阜豐生物科技有限公司；醋糟,齊齊哈爾黑龍釀造有限責(zé)任公司；白酒酒糟,北大倉集團(tuán)有限公司。

D301弱陰離子交換樹脂、001×7強(qiáng)陽離子交換樹脂及D201強(qiáng)陰離子交換樹脂,浙江爭(zhēng)光實(shí)業(yè)股份有限公司。D(+)-葡萄糖(glucose，Glu)、D(+)-木糖(xylose，Xyl)、L-阿拉伯糖(arabinose，Ara)，山東龍力生物科技股份有限公司；NaOH、四水酒石酸鉀鈉、CuSO4、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、濃HCl等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；濃H2SO4為國(guó)產(chǎn)色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械有限公司；布氏漏斗過濾器,蜀牛玻璃儀器有限公司；手持折光計(jì),成都泰華光學(xué)有限公司；有機(jī)玻璃離子交換柱,江蘇金三陽水處理科技江蘇有限公司；BIO RAD Aminex HPX-87H色譜柱，美國(guó)BIO-RAD公司；譜銳美高效液相色譜儀,日立公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 三種副產(chǎn)物半纖維素水解糖粗品的制備工藝流程

將玉米皮、醋糟、白酒酒糟分別用自來水浸泡12 h、反復(fù)沖洗以去灰塵等雜質(zhì)，洗凈后的玉米皮、醋糟、白酒酒糟用三足離心機(jī)進(jìn)行渣液分離，并置于105 ℃恒溫干燥箱中烘干，干燥后用粉碎機(jī)粉碎，過 40 目篩。

1.3.1.1 玉米皮半纖維素水解糖粗品的制備

以H2SO4作為催化劑，在H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%、水解溫度125 ℃、料液比1∶8條件下將玉米皮水解3 h，微型三足離心機(jī)3 000 r/min 離心10 min，取流出液加入0.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的粉末活性炭，置于振蕩器中75 r/min 振蕩30 min脫色，4 500 r/min 離心 10 min，取上清液，即得玉米皮半纖維素水解糖液粗品，備用。

1.3.1.2 醋糟半纖維素水解糖粗品的制備

以H2SO4作為催化劑，在H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%、水解溫度123 ℃、料液比1∶8條件下將醋糟水解2.5 h，微型三足離心機(jī)3 000 r/min 離心10 min，取流出液加入1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的粉末活性炭，置于振蕩器中80 r/min振蕩35 min脫色，4 500 r/min 離心10 min，取上清液，即得醋糟半纖維素水解糖液粗品，備用。

1.3.1.3 白酒酒糟半纖維素水解糖粗品的制備

以H2SO4作為催化劑，在H2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%、水解溫度123 ℃、料液比1∶8條件下將白酒酒糟水解3 h，微型三足離心機(jī)3 000 r/min 離心10 min，取流出液加入1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的粉末活性炭，置于振蕩器中75 r/min振蕩35 min脫色，4 500 r/min離心10 min，取上清液，即得白酒酒糟半纖維素水解糖液粗品，備用。

1.3.2 三種副產(chǎn)物半纖維素水解糖的分離純化

1.3.2.1 D301弱陰離子交換層析

將 D301弱陰離子交換樹脂活化后采用濕法裝柱(2.5 cm×20 cm)，以2倍柱體積的去離子水進(jìn)行沖洗，至水接近中性，取脫色后的半纖維素水解糖液樣品，上樣D301弱陰離子交換柱進(jìn)行分離純化，控制2倍柱體積的流量，用手持折光計(jì)隨時(shí)測(cè)出口的可溶性固形物濃度，當(dāng)出口糖液折光濃度達(dá)1 °Bx時(shí)，開始收集出口糖液；隨時(shí)測(cè)出口糖液的pH，當(dāng)檢測(cè)到出口pH和進(jìn)口pH基本持平時(shí)，說明柱子失效，停止上樣；用去離子水對(duì)樹脂進(jìn)行沖洗，控制流速為2 BV/h，當(dāng)出口糖液低于濃度1 °Bx時(shí)停止收集，收集到的出口糖液，備用。

1.3.2.2 001×7強(qiáng)陽離子交換層析

將 001×7強(qiáng)陽離子交換活化后采用濕法裝柱(2.5 cm×20 cm)，以2倍柱體積的去離子水進(jìn)行沖洗，至水接近中性，取經(jīng)D301弱陰離子交換層析收集到的樣品，上樣001×7 強(qiáng)陽離子交換柱進(jìn)行分離純化，控制2倍柱體積的流量，用手持折光計(jì)隨時(shí)測(cè)出口的可溶性固形物濃度，當(dāng)出口糖液折光濃度達(dá)1 °Bx時(shí)，開始收集出口糖液；隨時(shí)測(cè)出口糖液的pH，當(dāng)檢測(cè)到出口pH和進(jìn)口pH基本持平時(shí)，說明柱子失效，停止上樣；用去離子水對(duì)樹脂進(jìn)行沖洗，控制流速為2 BV/h，當(dāng)出口糖液低于濃度1 °Bx時(shí)停止收集，收集到的出口糖液，備用。

1.3.2.3 D201強(qiáng)陰離子交換層析

將D201強(qiáng)陰離子交換樹脂活化后采用濕法裝柱(2.5 cm×20 cm)，以2倍柱體積的去離子水進(jìn)行沖洗，至水接近中性，取經(jīng)001×7強(qiáng)陽離子交換層析收集到的樣品，上樣D201強(qiáng)陰離子交換柱進(jìn)行分離純化，控制控制2倍柱體積的流量，用手持折光計(jì)隨時(shí)測(cè)出口的可溶性固形物濃度，當(dāng)出口糖液折光濃度達(dá)1 °Bx時(shí)，開始收集出口糖液；隨時(shí)測(cè)出口糖液的pH，當(dāng)檢測(cè)到出口pH和進(jìn)口pH基本持平時(shí)，說明柱子失效，停止上樣；用去離子水對(duì)樹脂進(jìn)行沖洗，控制流速為2 BV/h，當(dāng)出口糖液低于濃度1 °Bx時(shí)停止收集，收集到的出口糖液，即為精制半纖維素水解糖。

1.3.3 半纖維素水解糖的單糖組成分析—高效液相色譜法

3種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)液配制：D-葡萄糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL，D-木糖質(zhì)量濃度為20 mg/mL，L-阿拉伯糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL，置于 4 ℃冰箱中備用，使用時(shí)按體積比1∶1∶1 混合，再進(jìn)行0.22 μm濾膜、超聲波脫氣處理。

待測(cè)樣品前處理：取精制半纖維素水解糖，加入超純水稀釋，稀釋至可溶性固形物濃度為10 mg/mL，再進(jìn)行0.22 μm濾膜過濾、超聲波脫氣處理，得 10 mg/mL的樣品水解糖液備用。

色譜條件：色譜柱：BIO RAD Aminex HPX-87H；流動(dòng)相0.005 mol/L硫酸溶液；流速0.600 mL/min；柱溫60 ℃；進(jìn)樣量20 μL；示差檢測(cè)器溫度45 ℃。

1.3.4 半纖維素水解糖相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.3.4.1 可溶性固形物濃度的測(cè)定

采用手持折光計(jì)法測(cè)定半纖維素水解糖液粗品、脫色后的半纖維素水解糖液、離子交換層析收集的精制半纖維素水解液糖樣品的可溶性固形物濃度。

1.3.4.2 總還原糖含量測(cè)定

采用斐林試劑法測(cè)定半纖維素水解糖液粗品、脫色后的半纖維素水解糖液、離子交換層析收集的精制半纖維素水解液糖樣品的總還原糖含量。

1.3.4.3 總還原糖損失率及純度計(jì)算

總還原糖損失率及純度如公式(1)、公式(2)所示：

(1)

式中：m1,處理前糖液中總還原糖質(zhì)量，g；m2,處理后糖液中總還原糖質(zhì)量，g。

(2)

式中：ρ1,糖液中的總還原糖質(zhì)量濃度，g/100mL；ρ2,糖液中的可溶性固形物質(zhì)量濃度,g/100mL。

1.3.4.4 電導(dǎo)率測(cè)定

采用電導(dǎo)率儀測(cè)定電導(dǎo)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化結(jié)果

通過活性炭脫色、D301弱陰離子交換層析、001×7強(qiáng)陽離子交換層析、D201強(qiáng)陰離子交換層析對(duì)3種副產(chǎn)物半纖維素水解糖進(jìn)行分離純化，獲得較好的效果。半纖維素水解糖的總還原糖回收率和純化情況如表1所示,水解得到的3種副產(chǎn)物的半纖維素水解糖粗品在脫色后可溶性固形物含量和電導(dǎo)率均有一定程度的降低，但總還原糖含量增加，說明脫色后糖液體積減少，即有一部分糖被活性炭吸附；水解糖的純度均升高，分別升高了4.13%、4.96%、8.50%，總還原糖的損失率分別為3.21%、2.96%、3.05%。

表1 三種副產(chǎn)物半纖維素水解糖純化結(jié)果Table 1 Purification of hydrolysis sugar from hemicellulose of three by-productions

脫色后的3種糖液經(jīng)D301離子交換層析后，可溶性固形物含量、電導(dǎo)率和總還原糖含量均有一定程度的降低，說明水解糖純度進(jìn)一步升高，分別升高了10.91%、18.28%、6.58%，總還原糖的損失率分別為2.74%、2.67%、2.66%。D301離子交換層析收集的糖液經(jīng)001×7離子交換層析后，可溶性固形物含量、電導(dǎo)率和總還原糖含量亦均有一定程度的降低，水解糖純度均再一次升高，分別升高了8.40%、2.42%、8.50%，總還原糖的損失率分別為2.30%、2.45%、2.91%。001×7離子交換層析收集的糖液經(jīng)D201離子交換層析后，可溶性固形物含量和總還原糖含量持續(xù)降低，水解糖純度持續(xù)升高，分別升高了14.18%、17.65%、16.53，總還原糖損失率分別為2.42%、2.30%、2.67%。

通過活性炭脫色、D301弱陰離子交換層析、001×7強(qiáng)陽離子交換層析、D201強(qiáng)陰離子交換層析進(jìn)行分離純化后，玉米皮半纖維素水解糖純度為87.83%，純度提高了42.95%，總還原損失率為10.67%；醋糟半纖維素水解糖的純度為85.00%，純度升提高了49.57%，總還原損失率為10.38%；白酒酒糟半纖維素水解糖的純度為87.20%，純度提高了46.19%，總還原損失率為11.29%。3種副產(chǎn)物的半纖維素水解糖均獲得了較好的純化效果，進(jìn)一步說明分離純化可更好的去除各種雜質(zhì)，提高糖的純度。

2.2 三種副產(chǎn)物半纖維素水解糖的單糖組分分析結(jié)果

糖類分析的主要目的有兩類：即單糖、寡糖的組成和多糖的分子質(zhì)量及其分布。糖類物質(zhì)的分離可以通過HPLC在色譜柱中實(shí)現(xiàn)。采用 BIO RAD Aminex HPX-87H高效液相色譜法對(duì)3種副產(chǎn)物半纖維素水解糖的單糖組成進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1～圖4所示。由圖1可得各標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間依次為D-葡萄糖8.666 min，D-木糖9.286 min，L-阿拉伯糖10.116 min。

由圖2可知，玉米皮半纖維素水解糖高效液相色譜圖中出現(xiàn)3個(gè)峰，保留時(shí)間與前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中蔗糖、乳糖、甘露糖、半乳糖、果糖、半乳糖醇、甘露糖醇、山梨醇、赤蘚糖醇、阿拉伯糖醇和木糖醇等11種標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間不同，而與D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品出峰保留時(shí)間一致，表明玉米皮半纖維素水解糖主要由D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖組成，其中D-木糖含量最高，各單糖物質(zhì)的量比為1.00∶3.49∶1.74。趙瑋[12]利用固體酸催化法對(duì)玉米皮半纖維素進(jìn)行水解，HPLC分析結(jié)果表明，玉米皮水解液主要由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖3種單糖組成，其中葡萄糖28.21%，木糖58.39%，阿拉伯糖13.41%。張莉莉[20]對(duì)玉米皮渣酸水解液中單糖組成進(jìn)行測(cè)定，離子色譜法分析發(fā)現(xiàn)，葡萄糖相對(duì)含量11.73%，木糖相對(duì)含量33.77%，阿拉伯糖相對(duì)含量20.74%，即各單糖物質(zhì)的量比為1.00∶2.88∶1.77；徐夢(mèng)瑩[21]利用酸性電解水為催化介質(zhì)，水解玉米皮半纖維素，脫色液連續(xù)兩次通過陽、陰離子串聯(lián)交換樹脂(001×7、201×7)后，所得糖液含有35.8%L-阿拉伯糖，33.4%D-木糖和30.8%低聚糖。這些結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在單糖組成類型上一致，但在單糖組成比例上存在一些差異，可能是由玉米皮半纖維素水解糖的提取純化方法、單糖測(cè)定方法不同造成的[22]。

由圖3可知，醋糟半纖維素水解糖高效液相色譜圖中出現(xiàn)的峰分別對(duì)應(yīng)單糖標(biāo)準(zhǔn)品峰1、2、3，表明醋糟半纖維素水解糖主要由D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖組成，其中D-木糖含量最高，各單糖物質(zhì)的量比為1.00∶2.70∶1.41。目前還未發(fā)現(xiàn)其他學(xué)者利用醋糟制備半纖維素水解糖的研究。由圖4可知，白酒酒糟半纖維素水解糖高效液相色譜圖中出現(xiàn)的峰分別對(duì)應(yīng)單糖標(biāo)準(zhǔn)品峰1、2、3，表明白酒酒糟半纖維素水解糖主要是由D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖組成，其中以D-葡萄糖含量最高，各單糖物質(zhì)的量比為1.00∶0.84∶0.16。李福佳[23]以濃香型白酒糟為原料，利用稀硫酸水解制備木糖提取液，經(jīng)中和、脫色、離子交換制備還原糖，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)葡萄糖含量為10.2%，木糖含量為80.8%，阿拉伯糖含量為9.0%，木糖含量最高，各單糖物質(zhì)的量比為1.00∶7.92∶0.88。該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在單糖組成類型上一致，但在單糖組成比例上存在一些差異，可能是因白酒酒糟原料來源、半纖維素水解糖提取純化方法、單糖測(cè)定方法的不同造成的。

1-D-葡萄糖；2-D-木糖；3-L-阿拉伯糖圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of monosaccharide standars

1-D-葡萄糖；2-D-木糖；3-L-阿拉伯糖圖2 玉米皮半纖維素水解糖高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of hydrolysis sugar from hemicellulose of corn husk

1-D-葡萄糖；2-D-木糖；3-L-阿拉伯糖圖3 醋糟半纖維素水解糖高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of hydrolysis sugar from hemicellulose of vinegar residue

1-D-葡萄糖；2-D-木糖；3-L-阿拉伯糖圖4 白酒酒糟半纖維素水解糖高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of hydrolysis sugar from hemicellulose of distiller′s grains

3 結(jié)論

玉米皮、醋糟、白酒酒糟半纖維素水解糖經(jīng)過低濃度酸法水解提取、水解糖溶液加入活性炭脫色后，再依次經(jīng)過D301弱陰離子交換層析、001×7強(qiáng)陽離子交換層析及D201強(qiáng)陰離子交換層析進(jìn)行分離，對(duì)分離純化后的糖液進(jìn)行收集，分別得到玉米皮精制半纖維素水解糖、醋糟精制半纖維素水解糖、白酒酒糟精制半纖維素水解糖。研究結(jié)果說明，采用D301弱陰離子交換層析、001×7強(qiáng)陽離子交換層析及D201強(qiáng)陰離子交換層析的方法可對(duì)玉米皮、醋糟、白酒酒糟半纖維素水解糖起到很好的分離純化效果。采用 HPLC對(duì)玉米皮、醋糟、白酒酒糟半纖維素水解糖進(jìn)行分析，通過與混標(biāo)的單糖標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖進(jìn)行對(duì)比分析，得到這3種原料的半纖維素水解糖均是由D-葡萄糖、D-木糖和L-阿拉伯糖3種單糖按照不同比例縮合而成，玉米皮半纖維素水解糖中各單糖物質(zhì)的量比為1.00∶3.49∶1.74；醋糟半纖維素水解糖中各單糖物質(zhì)的量比為1.00∶2.70∶1.41；白酒酒糟半纖維素水解糖中各單糖物質(zhì)的量比為1.00∶0.84∶0.16。

近年來，功能糖的發(fā)展促進(jìn)了農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物半纖維素水解糖的研究。為進(jìn)一步探索其生物學(xué)功能及作用機(jī)理，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物半纖維素水解糖的詳細(xì)結(jié)構(gòu)分析(如單糖組成、糖苷鍵連接方式等)的研究刻不容緩。本研究對(duì)玉米皮、醋糟、白酒酒糟半纖維素水解糖進(jìn)行了分離純化，對(duì)其單糖組成進(jìn)行了分析，研究結(jié)果可為半纖維素水解糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)解析及進(jìn)一步的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。