釀酒酵母與產香酵母發酵特性及其相互作用規律

吳健，何偉，王建成，楊玉蓉，藍彩紅，劉盛鋼，吳小霞，林峰，郭安，楊濤,*

1(中南林業科技大學 食品科學與工程學院，湖南 長沙，410000)2(長沙市食品藥品信息與審評認證中心，湖南 長沙，410000)3(四川邛崍金六福崖谷生態釀酒有限公司，四川 成都，611530)4(廣東德慶無比養生酒業有限公司，廣東 肇慶，526600)

米香型白酒作為我國基礎香型白酒之一，感官特點為“蜜香清雅、入口柔綿、落口爽洌、回味怡暢”[1]，主要呈現為乳酸乙酯、β-苯乙醇以及乙酸乙酯的復合蜜香，吸引了眾多的愛好者。然而，米香型白酒釀造原料與微生物體系單一，使得酒體干凈之余又風味不足，層次不夠豐富飽滿，給部分人一種飲之寡淡的感覺，這也是小曲酒一直以來在白酒市場中難以定位高端產品的原因之一。因此，如何增加米香型白酒的良好風味，成了相關企業的難點。

產香酵母泛指一類在生長代謝過程中可生成以酯類為代表的多種香味成分或其前體物質的酵母菌，又叫做產酯酵母或生香酵母[2-3]。近年來因其產香的特殊生理學性質而被廣泛應用于食品發酵相關領域，包括煙草香料、醬醋釀造、傳統面食、果酒醬發酵、白酒釀造等風味導向型產業[4-8]，起到豐富香氣，改善感官品質的作用，具備提升酒體感官品質的潛力。但單一種類的產酯酵母會代謝產生其特有的呈香物質，釀造過程中若只是添加單一產酯能力強的酵母，發酵產物中特定組分的濃度會增加，大大超出其風味閾值，從而破壞整體的良好感官，使白酒中出現明顯的“香蕉水味”“酸臭味”等不良氣味。因此對于產酯酵母的選擇應該多樣化，并對其相互作用進行研究，探索接種的最佳比例及方式，使得最終的發酵產品風味協調，層次豐富。同時產香酵母與小曲釀造微生物之間的相互作用常具有菌株差異性，也會受到發酵條件的影響，因此結合釀造工藝針對其發酵特性與菌株間相互作用的研究亟待開展。

以篩選得到并鑒定后的異常維克漢遜酵母、扣囊復膜酵母、克魯維畢赤酵母、釀酒酵母4株菌作為供試菌株，在探索其生長周期、抗逆性以及發酵特性的基礎上，研究了酵母間相互作用對菌體生長和關鍵代謝產物的影響。一方面對酵母相互作用的機理研究以及發酵動力學的進一步深入有著參考作用，另一方面使得企業生產時能準確把控整個發酵環節，解決風味的技術問題，對相關工藝的調整起著巨大的作用，這不僅能對米香型白酒生產的智能化建設提供技術支持，促進釀酒企業的發展，對整個白酒行業健康持續地發展也有著積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae，SC)、克魯維畢赤酵母(Pichiakudriazevii，PK)、異常維克漢遜酵母(Wickerhamomycesanomalus，WA)、扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera，SF)，以上菌株均為實驗室篩選鑒定得到并進行保藏的菌種。

1.1.2 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基(yeast extract peptone dextrose medium，YPD)(g/L)：酵母膏10、蛋白胨20，葡萄糖20，瓊脂2(液體培養基不加瓊脂)，加入純水溶解后121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(Potato dextrose agar medium，PDA)(g/L)：馬鈴薯200，葡萄糖20。馬鈴薯濾汁加入葡萄糖，補足水溶解后調節pH為4.5，于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

米曲汁培養基：參照毛宜詳等[9]和黃慧芬[10]的方法制備。

豆芽汁培養基、麥芽汁培養基：參照陳小龍等[11]的方法制備；

麩皮浸汁培養基：參照李國生等[12]的方法制備。

1.2 儀器與設備

UV-2600紫外、可見光分光光度計，日本島津公司；LRH-150生化培養箱，上海一恒科技有限公司；DK-98-2電熱恒溫水浴鍋，上海虔鈞科學儀器有限公司；SHA-C水浴恒溫搖床，上海金鵬分析儀器有限公司；HZQ-C氣浴恒溫搖床，常州恒隆儀器有限公司；WZ103手持式糖度儀，浙江托普云農科技股份有限公司；FE28pH計，METTLER TOLEDO；YXQ-LS-75G全自動數顯高壓滅菌器，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；BM1000生物顯微鏡，江南永新光學儀器有限公司；5804R臺式高速冷凍離心機，艾本德中國有限公司；Vortex genie2旋渦振蕩器，Scientific Industries。

1.3 實驗方法

1.3.1 形態學觀察

參照吳小霞[13]的方法進行形態學觀察。

1.3.2 生長曲線測定

參照李宇輝等[14]的方法采取比濁法測定各菌株的生長曲線。

1.3.3 抗逆性研究

1.3.3.1 耐酸性

將4種菌株進行活化后，參照滕超等[15]的方法，把YPD液體培養基的pH用HCl和NaOH分別調節為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，將酵母種子液以5%的接種量接種至培養基中，于30 ℃ 培養48 h后進行測定。

1.3.3.2 耐熱性

以5%接種量接種酵母活化液至三角瓶中，設置培養溫度分別為20、24、28、32、36、40、44、48、52 ℃，培養48 h后，利用比濁法在600 nm處測定吸光值，以培養溫度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制曲線，得到菌株在不同溫度下的生長情況。

1.3.3.3 乙醇耐受性

用無水乙醇調節YPD液體培養基的乙醇體積分數分別為0(即不加乙醇)、3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%，按5%接種量接種酵母活化液，于30 ℃培養48 h后，在600 nm處測定吸光值后繪制曲線，得到菌株的最高乙醇耐受濃度，對其乙醇耐受性進行評價。

1.3.3.4 糖耐受性

用葡萄糖調節YPD液體培養基的糖體積分數分別為15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%，按5%接種量接種酵母活化液，于30 ℃培養48 h 后，在600 nm處測定吸光值后繪制曲線，得到菌株的最高糖耐受濃度，對其高糖耐受性進行評價。

1.3.4 發酵特性研究

1.3.4.1 總酸總酯測定

參考盧亭等[16]的方法進行測定。

1.3.4.2 發酵液乙醇濃度測定

按GB 5009.225—2016[17]中酒精度的方法進行測定。

1.3.5 菌株相互作用研究

1.3.5.1 共培養對各菌株活菌數量的影響

大部分研究證明釀酒酵母對產香酵母有抑制作用，為排除菌株差異性，考察了兩者間的的相互作用。將釀酒酵母與3株產香酵母分別組合為SC-PK、SC-WA、SC-SF 3個組，分別按1×106CFU/mL的接種量共接種至米曲汁培養基內，于30 ℃培養箱混合培養48 h后，參考HO等[18]與白夢洋等[19]的方法對共培養組中WA、SF、PK、SC 4株酵母進行平板計數。同時分別進行純培養后計數作為對照。

同時，為研究產香酵母間的相互作用，將PK、WA、SF 3株產香酵母兩兩組合，用一種菌的發酵上清液對另外1種菌進行培養，研究其相互作用。取各菌株種子活化液，按1×106CFU/mL的接種量接種至米曲汁培養基中，在150 r/min的30 ℃氣浴搖床中培養24 h后，以8 000 r/min轉速離心5 min取其上清液，并在超凈工作臺中過0.25 μm有機濾膜，備用；以組合中的一種產香酵母的發酵上清液作為培養液，按1×106CFU/mL的接種量接種另外1株產香酵母，于30 ℃培養箱中培養48 h后，利用YPD瓊脂培養基進行平板計數。同時，用糖度與發酵上清液相同的米曲汁培養基在相同培養條件下做單菌對照培養。

1.3.5.2 接種比例對共培養代謝產物的影響

活化各菌株，參照ZHA 等[20]的接種量將WA、SF、PK種子液分別以3種不同的比例(106∶106∶105CFU/mL、105∶106∶106CFU/mL、106∶106∶106CFU/mL)接種至米曲汁培養基中，于30 ℃下培養72 h，在第24、36、48、60、72 h取樣，并過0.25 μm有機濾膜，參照標準DBS52/ 021—2016[21]中的方法測定乙醇、β-苯乙醇、乳酸乙酯、乙酸乙酯含量。同時在相同培養條件下進行單菌純培養作為對照培養并做定量分析。

在共培體系中加入SC，將SC、WA、SF、PK的種子活化液以3種不同的比例(105∶106∶106∶106CFU/mL、106∶ 106∶106∶106CFU/mL、107∶106∶106∶106CFU/mL)接種至米曲汁中，于30 ℃下培養72 h，在第24、36、48、60、72 h取樣測定4種關鍵物質含量。同時做對照培養處理：將3株產香酵母按106∶106∶106CFU/mL的比例進行接種，在相同培養條件下進行對照培養并做定量分析。

1.3.5.3 接種順序對共培養代謝產物的影響

為研究制種過程中釀酒酵母與產香酵母接種順序對混合發酵過程中關鍵代謝產物的影響規律，固定產香酵母的接種比例與接種方式為106∶106∶106CFU/mL，同時接種。待3株產香酵母接種完畢的第0(即同時接種)、8、12、16、20、24 h后按接種比例為106CFU/mL接種釀酒酵母，再共發酵72 h，利用氣相色譜分析代謝產物含量。

2 結果與分析

2.1 菌株形態學

2.1.1 菌株菌落形態

記錄各菌株單菌落基本形態，結果見表1。釀酒酵母與異常維克漢遜酵母形態相似，均為直徑1～2 mm的凸起狀半圓球；克魯維畢赤酵母為4～5 mm的中間凸起狀圓形菌落，扣囊復膜酵母為直徑5～7 mm的均勻凸起狀同心圓菌落且不易挑起，表面的假菌絲能輕松刮下，但內部呈現出果肉狀的菌體，與紅曲霉菌較為相似，具有一定硬度。各菌株菌落見圖1。

表1 菌株的基本菌落形態Table 1 The basic colony morphology of the yeast strains

2.1.2 菌株細胞形態鏡檢圖

菌株細胞形態及鏡檢圖如圖1所示。

a-釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；b-克魯維畢赤酵母(Pichia kudriazevii)；c-扣囊復膜酵母(Sacharomyyees fibuligera);d-異常維克漢遜酵母(Wickerhamomyces anomalus)圖1 菌株的菌落及細胞形態Fig.1 The colony and cell morphology of the yeast strains注：細胞形態圖為光學顯微鏡1 000倍放大鏡檢圖

2.2 菌株生長曲線

由圖2可知，4株酵母的生長周期差異明顯，0～4 h均處于生長延滯期，進入對數生長期后，各菌株迅速增殖，由于生長速度的不一致，菌體濃度、營養物質與生長因子的消耗速度也有所不同，生長限制到來的時間存在一定差異，在第24 h后，釀酒酵母與扣囊復膜酵母結束對數生長，率先進入穩定期，生長趨于平緩；第28 h后異常維克漢遜酵母也隨之進入穩定期，而克魯維畢赤酵母的生長速度則相對較緩，在第32 h后也進入了穩定期。

圖2 酵母菌株的生長曲線Fig.2 The growth curve of the yeast strains

對數生長期的菌體活力最強，此階段微生物利用營養物質不斷增殖，生長條件適宜的情況下，基本不會出現死亡細胞，因此菌株接種時應選擇對數生長期增殖活力較強的細胞。而穩定期則是微生物累積代謝產物的階段，通過不同方法延長穩定期有利于目標產物的生成，提高生物轉化率。

2.3 菌株抗逆性

實際工業釀酒過程中，會出現不利于菌株正常生長發酵的環境脅迫，如超過適宜生長范圍的高溫、高酸，濃繆發酵下的高滲透壓脅迫，以及代謝物累積過程中的高濃度乙醇，均會對酵母的發酵活力與增殖能力產生極大的損害，從而反向抑制發酵過程。因此，針對酵母在各種脅迫下的抗逆性進行了研究，考察了酵母的釀造潛力。

由圖3可知，釀酒酵母與產香酵母在44 ℃仍能增殖，但繼續提升培養溫度至48 ℃，所有酵母均難以生長。能保證正常發酵的生長溫度則具有一定差異性，其中釀酒酵母與異常維克漢遜酵母的最適生長溫度為28 ℃，40 ℃之后則出現明顯的生長受限；扣囊復膜酵母最適生長溫度為32 ℃，40 ℃之后生長開始受到明顯抑制，菌體增殖較少；而克魯維畢赤酵母在升溫培養的過程中，表現出了較高的熱敏感性，最適生長溫度為32 ℃，繼續升溫其生長開始受限，但其耐熱性能卻是4株酵母中最好的。這可能是發酵液中存在熱保護性的物質，從而增加了酵母的耐熱性，如糖可以作為熱保護劑使酵母的耐熱性能得到一定程度的提高[22]。

a-培養溫度；b-培養基pH；c-乙醇體積分數；d-葡萄糖體積分數圖3 酵母的抗逆性測定Fig.3 Determination on stress resistance of yeast strains

同時，4株酵母均具備良好的耐酸能力，其中異常維克漢遜酵母最適生長pH為5.0，能耐受的最低pH為2.0，耐酸性最強，其余3株酵母的最適生長pH分別為5.5、4.5、6.0，且能耐受的最低pH均為2.5。

在乙醇耐受性方面，釀酒酵母最高，在12%仍能良好生長，15%時能長但嚴重受抑制；扣囊復膜酵母次之，在9%能良好生長，12%能長但嚴重受抑制；畢赤酵母和異常維克漢遜酵母最弱，在6%能良好生長，9%能長但嚴重受抑制；4株酵母在乙醇體積分數達到18%后基本停止生長，其中低濃度(3%)能促進釀酒酵母與漢遜酵母生長。雖然高濃度的乙醇會通過抑制葡萄糖和氨基酸的轉運，以及丙酮酸激酶和己糖激酶等關鍵的糖酵解酶的變性，并增加膜的通透性使酵母喪失正常的生理功能[23]，但低濃度的乙醇反而對酵母生長具有促進作用，相關機理有待進一步研究。

此外，4株酵母菌也具備良好的糖耐受能力，其中扣囊復膜酵母高糖耐受性最佳，在40%糖體積分數下能良好生長，45%時受到較大生長抑制；釀酒酵母、異常維克漢遜酵母均在35%糖體積分數下能良好生長，40%時受到較大生長抑制；而畢赤酵母最弱，在30%糖體積分數下能良好生長，40%時受到較大生長抑制。高滲透壓脅迫下，酵母菌會發生應激反應以調節細胞內物質與酶活力來適應不良環境[24]，這對濃繆發酵具有極大意義。但暴露在極端的滲透壓環境下，微生物細胞內的水分缺失，細胞發生收縮，結構受到嚴重破壞，從而停滯生長[25]。

2.4 菌株發酵特性

釀酒酵母與產香酵母均具備一定產酸酯和乙醇的能力，為了在之后的制曲過程中對菌株進行合理的搭配，對4株酵母產酸酯、乙醇等特性進行了研究，通過模擬米香型白酒發酵，在米曲汁培養基中接種各菌株種子液，考察了其發酵特性。

由圖4可知，產乙醇的能力由強到弱依次排序為釀酒酵母、克魯維畢赤酵母、異常維克漢遜酵母、扣囊復膜酵母，4株酵母經接種后發酵72 h，發酵液中的乙醇體積分數分別為8.0%、5.6%、3.4%、2.2%，除了釀酒酵母外，其余3株產香酵母也具備一定產酒能力；產酸的能力排序為扣囊復膜酵母>畢赤酵母>漢遜酵母>釀酒酵母，分別為3.57、2.96、1.95、1.50 g/L；產酯能力為畢赤酵母>漢遜酵母>扣囊復膜酵母>釀酒酵母，分別為3.09、2.78、2.54、0.38 g/L。

圖4 酵母發酵特性的測定Fig.4 Determination on fermentative characteristic of yeast strains

發酵體系中，一定含量的酸酯對于風味有積極的作用，加入產香酵母能顯著增強發酵液中的酯含量，4株酵母中釀酒酵母具備優秀的發酵能力，其余3株產香酵母在擁有一定發酵產酒能力的同時，產酯能力可觀，共發酵過程中能起到明顯的增香效果。

2.5 菌株相互作用

2.5.1 釀酒酵母與產香酵母共培養對菌體生長的影響

將釀酒酵母分別與其余酵母混合培養，研究兩者間相互的生長影響。由圖5-a可知，3株產香酵母在與釀酒酵母共培后，體系中的活菌數量顯著性下降，釀酒酵母對異常維克漢遜酵母、克魯維畢赤酵母、扣囊復膜酵母的生長均有不同程度的抑制作用。而從圖5-b中則可看出，在異常維克漢遜酵母影響下，釀酒酵母數量輕微降低；而扣囊復膜酵母與克魯維畢赤酵母輕微促進了釀酒酵母的生長。但總體差異不具備統計學意義，可認為3株產香酵母對釀酒酵母的生長沒有顯著影響。

a-釀酒酵母對產香酵母生長的影響;b-產香酵母對釀酒酵母生長的影響圖5 釀酒酵母與產香酵母相互作用對活菌數的影響Fig.5 Effect of the interaction between saccharomyces cerevisiae and the aroma-producing yeast on the number of viable colony注：**表示釀酒酵母對產香酵母的生長影響顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示產香酵母對釀酒酵母的生長影響顯著(P<0.05)；A、B、C、D分別表示釀酒酵母、異常維克漢遜酵母、扣囊復膜酵母、克魯維畢赤酵母純培養活菌數；“A-B”表示A與B共培養后共發酵體系中B的活菌數，A-C、A-D、B-A、C-A、D-A同理

釀酒酵母對于產香酵母的抑制作用已有很多報道，通常認為是前者的代謝產物造成了后者生長的不利條件，包括產酸與乙醇，同時高密度的細胞也對產香酵母的增殖造成了消極影響[26]，但兩者的相互作用也有微生物種系的差異性[27]。本實驗共培養研究結果顯然與這類研究相符，因此釀酒酵母可能會造成共培養體系中產香酵母的早衰。而產香酵母對于釀酒酵母在活菌數量上的影響沒有顯著的表現，這可能與釀酒酵母良好的乙醇耐受性有關，同時也與產香酵母的生長速度以及產乙醇的能力相關。與其余2株產香酵母相比，異常維克漢遜酵母對數期的生長速度較快，且到達穩定期后菌體濃度與釀酒酵母相差不大，可能是通過細胞間的接觸對釀酒酵母產生了輕微的抑制作用，但由于釀酒酵母是前期生長的優勢菌株且具備優秀的抗逆性，因此這種影響非常小。同時有研究認為，非釀酒酵母在與釀酒酵母共培養的前期能促進后者的糖與氮代謝[28]，對其生長有利，這可能也是扣囊復膜酵母與畢赤酵母輕微促進釀酒酵母菌體數量增加的原因，但作用同樣非常有限。

2.5.2 產香酵母間的共培養對菌體生長的影響

產香酵母種類眾多且生理特性相似，當多種產香酵母作為主要功能性微生物共存于一個發酵體系中時，對其共培生長規律的探索必不可少。為研究3株酵母兩兩之間的共培養情況，利用菌株的單菌發酵上清作為培養液。由圖6-a、圖6-c可知，異常維克漢遜酵母與扣囊復膜酵母相互間的生長并無太大影響，扣囊復膜酵母與克魯維畢赤酵母間的生長也沒有顯著性的抑制或促進作用。而由圖6-b 可知，用克魯維畢赤酵母的發酵上清液對異常維克漢遜酵母進行培養，顯著抑制了后者的增殖；而克魯維畢赤酵母對于異常維克漢遜酵母則無明顯影響。

從兩兩組合的培養結果來看，3株產香酵母中，只有克魯維畢赤酵母對于異常維克漢遜酵母的生長有顯著的抑制作用。利用上清進行培養消除掉了因生長速度與周期不同帶來的細胞接觸抑制的可能性，而從發酵特性來看，畢赤酵母產酸與乙醇的能力均比漢遜酵母強，因此培養環境中酸脅迫與乙醇脅迫是導致后者活菌數量下降的可能原因，而對比異常維克漢遜酵母與扣囊復膜酵母的培養組合可以發現，產酸能力比克魯維畢赤酵母強的扣囊復膜酵母同樣造成了一個酸脅迫的環境，但對異常維克漢遜酵母并無明顯抑制作用，因此推測乙醇是降低異常維克漢遜酵母菌體數量的主要因素。而其余菌株間的影響均不明顯，這也體現了菌株的相互作用具有種系的差異，作用機制深入有待進一步研究。

2.5.3 接種比例對共培養代謝產物的影響

2.5.3.1 不同接種比例對產香酵母共培養代謝產物的影響

釀酒酵母對其余3株產香酵母具有明顯的抑制性作用，而產香酵母間除了克魯維畢赤酵母會一定程度抑制異常維克漢遜酵母生長之外，其余菌株均無明顯負面影響。因此先對產香酵母間的共培養接種比例進行研究，探索不同接種比例下產香酵母代謝產物的變化規律。

a-異常維克漢遜酵母與扣囊復膜酵母的相互影響;b-異常維克漢遜酵母與克魯維畢赤酵母的相互影響;c-扣囊復膜酵母與克魯維畢赤酵母的相互影響圖6 產香酵母間相互作用對活菌數的影響Fig.6 Effect of the interaction in the aroma-producing yeast on the number of viable colony注：不同小寫字母表示活菌數量有顯著性差異(P<0.05)；B、C、D分別表示異常維克漢遜酵母、扣囊復膜酵母、克魯維畢赤酵母純培養活菌數；“B-C”表示以B的上清液培養C后C的活菌數，B-D、C-D同理

結合供試菌株的發酵特性并參考了已有的研究基礎[20]，以單菌發酵作為對照，并將異常維克漢遜酵母、扣囊復膜酵母、克魯維畢赤酵母的種子活化液分別以3種不同的比例(106∶106∶105、105∶106∶106、106∶106∶106CFU/mL)接種至米曲汁培養基中進行發酵，結果如圖7所示。

a-β-苯乙醇；b-乳酸乙酸；c-乙酸乙醇；d-乙醇圖7 不同接種比例下產香酵母共培養代謝產物的測定Fig.7 Changes of metabolites in co-culture of the aroma-producing yeast under different inoculation ratio注：B、C、D分別為異常維克漢遜酵母、扣囊復膜酵母、克魯維畢赤酵母；B∶ C∶ D-105∶ 106∶ 106表示B、C、D 3株酵母的共培養接種比例分別為105、106、106CFU/mL，其他標示同理

隨著發酵時間增加，發酵液中各種風味物質的含量逐漸上升。在圖7-d中，培養至60 h后，不同比例混合接種的發酵液中乙醇含量均有提高。但繼續培養至72 h，各比例發酵組中乙醇均有不同程度的下降，此時接種比例為106∶106∶106CFU/mL的發酵組中乙醇質量濃度最高，達到44 773.23 mg/L。由圖7-a、圖7-c可知，發酵啟動24 h后，不同比例的混菌發酵液中乙酸乙酯、β-苯乙醇的含量均所有提高，其中106∶106∶106CFU/mL發酵組的結果最佳，培養至72 h，分別為4 818.57、372.70 mg/L。在發酵過程中乙酸乙酯含量逐漸升高而后趨于平緩，但β-苯乙醇表現為先升后降的趨勢。而乳酸乙酯的含量則有所不同，如圖7-b所示，扣囊復膜酵母單菌發酵產乳酸乙酯的能力在前48 h內最強，隨著發酵時間延長至72 h，105∶106∶106CFU/mL 發酵組與106∶106∶106CFU/mL發酵組中的乳酸乙酯含量才高過扣囊復膜酵母，此時最優的發酵組比例是106∶106∶106CFU/mL，乳酸乙酯質量濃度為865.71 mg/L。綜上，產香酵母不同比例的混合培養中，當接種量為106∶106∶106CFU/mL時，發酵液中乙醇、β-苯乙醇、乳酸乙酯、乙酸乙酯含量較高。

乳酸乙酯、乙酸乙酯、β-苯乙醇是米香型白酒香氣與風格形成的主要物質。其中β-苯乙醇等醇類物質除了本身呈香之外，同時還是生成其他香氣成分如乙酸苯乙酯的前體物，這可能也是發酵過程中其含量先增后降的一個原因。此外從乳酸乙酯的生成情況來看，扣囊復膜酵母的單菌發酵在前48 h內的產量較高，后期趨于平緩至穩定，而混菌發酵中雖然前期的產量較低，但一直保持穩定的升高。酵母的生長是代謝產物積累的必要前提，對比單菌發酵結果來看，產香酵母共培養也可能發生接觸性抑制從而使得扣囊復膜酵母的生長放緩，因此前期乳酸乙酯的含量反而在單菌發酵液中較高。從單菌發酵的結果來看，克魯維畢赤酵母的乙酸乙酯產量比其余兩株菌要高，因此加大其接種的比例會一定程度上提高乙酸乙酯含量。3株產香酵母以106∶106∶106CFU/mL的接種量進行共培養，對比各菌株的純培養結果來看，各關鍵物質的含量均有所提高，這與白夢洋等[29]的研究結果有相似之處。

2.5.3.2 不同接種比例對釀酒酵母與產香酵母共培養代謝產物的影響

為進一步研究添加釀酒酵母與產香酵母共培后風味物質的變化情況，在產香酵母共培的研究基礎上，固定產香酵母的接種比例為106∶106∶106CFU/mL，探索不同的釀酒酵母的接種比例對共培代謝物的影響，結果如下。

a-β-苯乙醇；b-乳酸乙酯；c-乙酸乙酯；d-乙醇圖8 不同接種比例下釀酒酵母與產香酵母共培養代謝產物的變化規律Fig.8 Changes of metabolites in co-culture of Saccharomyces cerevisiae and the aroma-producing yeast under different inoculation ratio注：A、B、C、D分別為釀酒酵母、異常維克漢遜酵母、扣囊覆膜酵母、克魯維畢赤酵母；A∶ B∶ C∶ D-105∶106∶ 106∶ 106表示A、B、C、D 4株酵母的共培養接種比例分別為105、106、106、106CFU/mL，其他標示同理

由圖8可知，對比產香酵母的混合發酵，添加釀酒酵母與產香酵母混合發酵至72 h后，發酵液中β-苯乙醇、乙醇等醇類物質的含量明顯提高，但乳酸乙酯、乙酸乙酯等酯類物質的含量有不同程度的降低。在圖7-d中，釀酒酵母以3種不同的比例接種到共發酵體系中，都能顯著增加乙醇的含量，以其中106∶106∶106∶106、107∶106∶106∶106CFU/mL 2種接種比例較好，乙醇質量濃度分別為62 194.41、63 145.38 mg/L；β-苯乙醇的生成也具有相似的規律，如圖8-a所示，其含量在106∶106∶106∶106CFU/mL的混合接種比例中最佳，發酵72 h后達到767.75 mg/L。由圖8-b、圖8-c可知，在產酯方面，釀酒酵母的產酯量很低，與對照組相比，釀酒酵母的接種還降低了發酵體系中乳酸乙酯與乙酸乙酯的含量。其中106∶106∶106∶106CFU/mL接種的發酵組中乳酸乙酯相對較多，質量濃度為764.30 mg/L；同時從乙酸乙酯的生成情況來看，105∶106∶106∶106CFU/mL與106∶106∶106∶106CFU/mL 2種比例下的乙酸乙酯質量濃度較高，分別為3 918.91、3 643.93 mg/L。綜合考慮發酵體系中風味物質的多樣性與含量，選擇106∶106∶106∶106CFU/mL作為釀酒酵母與產香酵母混合發酵的接種比例，最有利于4種關鍵代謝產物的產生。

從單菌發酵的結果來看，釀酒酵母是高級醇與乙醇的主要產生菌，通常認為β-苯乙醇等高級醇類物質是酵母在酒精發酵過程中通過埃利希途徑產生[30]，適宜濃度下具有芳香氣味，對酒體的風味起著積極的作用[31]。因此釀酒酵母接種比例增大，這2種物質的含量也隨之升高。但釀酒酵母與產香酵母共培養，對于酯類物質的產生起到了負面的作用，可能是因為釀酒酵母的生長抑制了產香酵母的生長，從而減少了酯類代謝物質的生成，這與菌株相互作用的研究規律相符。

2.5.4 接種順序對共培養代謝產物的影響

考慮到接種釀酒酵母與產香酵母混合培養對共發酵體系代謝產物中的酯類物質的產生具有一定的抑制作用，因此在接種產香酵母后的0、8、12、16、20、24 h接種釀酒酵母，研究不同接種順序下代謝產物的變化規律，找出最適合釀酒酵母的接種方式。結果如圖9所示。

不同接種順序對于共發酵影響較大，如圖9-a所示，隨著釀酒酵母的接種時間被延后，乙醇產量呈現先升后降的趨勢，在第8 h出現最大值67 242.68 mg/L；乳酸乙酯也具有一樣的趨勢，在第12 h有最大值753.34 mg/L；而β-苯乙醇則相反，其含量隨著釀酒酵母接種時間的延后而降低；乙酸乙酯則是先升高后降低，在第16 h有最大值4 951.73 mg/L。

釀酒酵母與產香酵母的接種順序對于4種主要的代謝產物都具有顯著影響，在接種產香酵母后的8 h接種釀酒酵母，測得發酵液中乙醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯的含量均有所提升，但β-苯乙醇含量稍微降低。這可能和酵母的生長以及發酵特性有關。3株產香酵母具有一定的產酒能力，但總體的生長受到乙醇的抑制，接種產香酵母培養一段時間后，菌株開始進入對數生長期，這一方面對酯類物質的產生具有促進作用，另一方面由于其本身也產乙醇，因此乙醇含量也有所提高，而β-苯乙醇的含量雖有所降低，但與同時接種相比并無明顯差異。ESCRUBANO-VIANA等[32]的研究也發現了同樣的規律，認為順序接種對于釀酒過程中的香氣具有明顯的改善作用，但也具備菌株差異性。因此在混合培養時，選擇在接種產香酵母后的8 h接種釀酒酵母，對于呈香物質的累積具有積極意義。

3 結論

以釀酒酵母、異常維克漢遜酵母、扣囊復膜酵母、克魯維畢赤酵母4株菌為供試菌株，從菌株形態、生長周期、抗逆性以及發酵特性等釀造相關的生理特性進行了研究，并探索了菌株間相互作用對菌體生長與代謝的影響。

結果表明，4株菌都具備良好抗逆性；均可耐受44 ℃；PK、SF、SC均可耐受pH 2.5，WA可耐受pH 2.0；同時，PK、SF、WA均可耐受9%乙醇，而SC可耐受12%乙醇；此外，PK、SF、SC、WA可耐受的糖體積分數分別為30%、40%、35%、35%。此外在發酵特性方面，產酸能力最強的是SF，3.57 g/L；產酯能力最強的是PK，3.09 g/L；產乙醇能力最強的是SC，發酵液中乙醇體積分數為8.0%。

共培養結果表明，釀酒酵母對于其余3株產香酵母的生長均有抑制作用，而產香酵母對于釀酒酵母的生長則沒有明顯的影響。在異常維克漢遜酵母與克魯維畢赤酵母的組合中，后者的代謝產物顯著抑制了前者的生長，而異常維克漢遜酵母并無明顯抑制克魯維畢赤酵母生長的現象，其余的菌株組合中均未出現顯著的抑制或者促進作用。同時，共培養時產香酵母的最優接種比例為106∶106∶106CFU/mL，釀酒酵母最優接種比例為106CFU/mL，在接種產香酵母8 h后進行釀酒酵母的接種，共培養發酵液中風味物質的含量最優，對于米香型白酒的香氣有積極的作用。