貴州不同酒曲在刺梨酵素發(fā)酵菌劑制備中的應(yīng)用

王瑜，李立郎，解春芝，楊禮壽，楊娟，萬麗英，楊小生*

1(貴州醫(yī)科大學(xué)，藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽，550014)2(貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽，550014)3(徐州工程學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州，221018)4(六盤水職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 六盤水，553001)

酵素是利用微生物的新陳代謝產(chǎn)物的作用，將發(fā)酵原料中的糖類、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，富含多種生物活性物質(zhì)，如醇、酸、醛、酯、維生素、酶、有機(jī)酸等的功能性產(chǎn)品[1]。酵素的發(fā)酵方式有自然發(fā)酵和純種發(fā)酵2種，其中常用的純種發(fā)酵劑優(yōu)勢微生物有乳酸菌、酵母菌及醋酸菌等，采用復(fù)合菌劑強(qiáng)化發(fā)酵，利用優(yōu)勢菌群在酵素食品發(fā)酵體系中快速構(gòu)建出有益的微生物菌群，抑制腐敗菌、致病菌等雜菌的生長，形成新的代謝產(chǎn)物和風(fēng)味物質(zhì)[2]。目前對于酵素中微生物菌群組成研究較少，MA等[3]采用單分子實(shí)時測序技術(shù)分析了日本和中國臺灣市場上銷售的酵素細(xì)菌組成及多樣性，鑒定了43個菌屬，優(yōu)勢菌群主要為嗜鉻桿菌屬、乳酸菌屬、分枝桿菌屬。凌空等[4]分離鑒定了果蔬酵素不同發(fā)酵周期中微生物，從3種不同發(fā)酵周期的果蔬酵素中分離篩選得到15株菌種。高慶超等[5]采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析了不同發(fā)酵階段的黑果枸杞酵素微生物的群落組成及多樣性，發(fā)現(xiàn)黑果枸杞酵素在發(fā)酵期0～20 d細(xì)菌群落多樣性和豐富度相對較高，在發(fā)酵期30～50 d真菌群落多樣性和豐富度相對較高。通過研究鑒定了果蔬發(fā)酵中的主要微生物菌群，以獲得安全的發(fā)酵劑及為產(chǎn)品的穩(wěn)定性和風(fēng)味提供指導(dǎo)作用[6]。但采用酒曲提供微生物發(fā)酵制備酵素的研究相對較少，更無對微生物群落結(jié)構(gòu)和功能因子之間的相關(guān)性研究。

因此，本研究通過采集貴州省7個不同行政區(qū)域當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)酒曲發(fā)酵刺梨酵素，運(yùn)用高通量測序方法對刺梨酵素細(xì)菌群落組成和多樣性進(jìn)行分析，比較微生物群落結(jié)構(gòu)差異，同時測定刺梨酵素中的主要功能成分與主要細(xì)菌種群做相關(guān)性分析，為刺梨酵素發(fā)酵劑的制備以及刺梨酵素中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能成分之間的相關(guān)性提供依據(jù)，為刺梨酵素的標(biāo)準(zhǔn)化開發(fā)提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨，貴州貴定敏子食品有限公司；酒曲，來源見1.3；纖維素酶，南寧龐博生物工程有限公司；DNA抽提試劑盒，F(xiàn)astDNA?Spin Kit for Soil；齊墩果酸(純度99%)，中國藥品生物制品檢定所；蘆丁(純度94.47%)、VC(純度98%)，貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SKG-PB-936打漿機(jī)，上海達(dá)瑞寶公司；BS-210S電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；AG285微量分析天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；GZX-9420MBE鼓風(fēng)烘箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；PAL-1 ATAGO糖度計，日本愛拓(愛拓)中國分公司；TCL-168離心機(jī)，上海安亭科技儀器廠；UV-1800紫外分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Millipore-0026高效液相色譜儀，美國Thermo Fisher公司； ABSON MiFly-6微型離心機(jī)，合肥艾本森科學(xué)儀器有限公司；Eppendorf 5430 R小型離心機(jī)、Eppendorf；NanoDrop2000超微量分光光度計，Thermo Fisher Scientific；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠； Illumina Miseq MISEQ測序儀，Illumina；QL-901旋渦混合器，海門其林貝爾儀器制造有限公司；TL-48R粉碎研磨儀，上海萬柏生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酒曲的采集與刺梨酵素的制備

(1)酒曲的采集：根據(jù)貴州省行政區(qū)域的劃分，按照區(qū)域具有代表性的原則，以貴陽為中心，選擇貴州的東、西、南、北4個區(qū)域地點(diǎn)，于2018年9～10月，分別在貴州省貴陽市花溪區(qū)(GY)、遵義赤水市(ZY)、銅仁地區(qū)德江縣(TR)、黔西南州興仁縣(QXN)、黔東南州凱里市(QDN)、黔南州龍里縣(QN)和畢節(jié)大方縣(BJ)7個行政區(qū)域采集傳統(tǒng)釀酒用高溫大曲用于制備刺梨酵素。

(2)刺梨酵素的制備：取新鮮刺梨洗凈去蒂，按照m(刺梨鮮果)∶m(純凈水)=1∶2打漿混合后，按照其總質(zhì)量的10%白糖，攪拌使白糖完全溶化，添加0.02%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))纖維素酶，0.03%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))貴州不同區(qū)域采集的酒曲粉末，酒曲使用前采用溫水活化，混合均勻后將其轉(zhuǎn)至陶瓷壇內(nèi)，陶瓷壇采用100目紗布封口，在18～25 ℃下有氧發(fā)酵。待發(fā)酵3個月后，pH值降至3～4，糖度降至4%～5%，產(chǎn)品澄清透明，呈淡黃色，取表面上清液冷藏備用。

1.3.2 不同區(qū)域酒曲發(fā)酵刺梨酵素的功能成分檢測方法

刺梨酵素中功能成分總?cè)坪涂傸S酮采用紫外分光光度計，參考南瑩等[7]的方法測定，其中總?cè)埔札R墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，總黃酮以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，VC采用高效液相色譜儀測定，色譜柱為Topsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；糖度采用糖度計測定。

1.3.3 樣品DNA提取與高通量測序分析

(1)樣本收集：取不同酒曲發(fā)酵的刺梨酵素液體樣品，離心后倒掉上清液，將菌體沉淀在-80 ℃下冷凍后，干冰保存狀態(tài)下送至深圳微科服科技有限公司進(jìn)行DNA提取與細(xì)菌菌群檢測。

(2)DNA抽提和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增：根據(jù)FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒使用說明書進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進(jìn)行檢測，利用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量；采用338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)引物對V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR試驗(yàn)采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；20 μL反應(yīng)體系：擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min，27個循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為20 μL，4 μL 5×FastPfu緩沖液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μmol/L引物(5 μmol/L)，0.4 μL FastPfu聚合酶； 0.2 μL BSA； 10 ng DNA模板[8]。

(3)Illumina Miseq測序：使用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA) 進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor-ST (Promega, USA) 進(jìn)行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq平臺 (Illumina, San Diego, USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2×300的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用 QIIME 2.0 軟件包，對測序片段進(jìn)行分類操作單元(operational taxonomic units，OUT)聚類，OUT代表序列與Greengene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，獲取 OUT 對應(yīng)的分類單元及其相應(yīng)的豐度信息；計算 Shannon index和Observed-OTU index度量指數(shù)，評估樣品中細(xì)菌菌群的豐富度和多樣性；綜合應(yīng)用 PCA 分析、LEfSe 分析、ANOVA 方差分析等方法分析樣品中的微生物菌群；應(yīng)用冗余分析(redundancy analysis，RDA) 分析關(guān)聯(lián)菌群結(jié)構(gòu)和刺梨酵素功能成分總?cè)啤⒖傸S酮、VC及糖度的相關(guān)性，利用Excel 2010和SPSS Statistics 20.0等統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取結(jié)果

采用338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)引物對V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶均在750 bp 左右，條帶長度和亮度較好，表明DNA含量較高，可上機(jī)檢測進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 不同酒曲發(fā)酵的刺梨酵素微生物OTU數(shù)目分析

通過檢測不同區(qū)域酒曲發(fā)酵的刺梨酵素共22個樣品，得到有效序列1 139 057條，平均每個樣品51 775條。圖1是展現(xiàn)不同區(qū)域間共有和特有OTU數(shù)目的花瓣圖，由圖1可知，7個區(qū)域共有的OTU數(shù)目為46，貴陽特有的OTU數(shù)目為500，畢節(jié)特有的OTU數(shù)目為840，遵義特有的OTU數(shù)目為277，銅仁特有的OTU數(shù)目為1 125，黔西南特有的OTU數(shù)目為618，黔南特有的OTU數(shù)目為559，黔東南特有的OTU數(shù)目為433。

圖1 不同區(qū)域間共有和特有OTU數(shù)目花瓣圖Fig.1 Common and unique OTU number of petals among different regions

2.3 不同酒曲發(fā)酵的刺梨酵素微生物群落的α-多樣性分析

圖2是畢節(jié)、貴陽、黔東南、黔南、黔西南、銅仁、遵義(BJ、GY、QDN、QN、QXN、TR、ZY)7個地區(qū)間α-多樣性盒形圖，更直觀顯示不同區(qū)域間α-多樣性差異。α-多樣性指數(shù)是對樣品中物種多樣性的分析，包含樣品中的物種組成豐富度和均勻度2個因素，通常用Shannon指數(shù)來評估某個樣本的物種多樣性，Shannon值越大，表明樣本的多樣性越復(fù)雜；而用Observed-OTU指數(shù)來評估樣本的物種豐富度呈正相關(guān)，Observed OTU指數(shù)是指樣本中實(shí)際測定得到的OTU數(shù)量，衡量樣品中OTU豐富度的指數(shù)。

A-Shannon指數(shù)統(tǒng)計分析；B-Obsrved-OTU指數(shù)統(tǒng)計分析；C-Shannon指數(shù)組間差異檢驗(yàn)；D-Obsrved-OTU指數(shù)組間差異檢驗(yàn)圖2 不同區(qū)域酒曲發(fā)酵刺梨酵素微生物α-多樣性盒形圖Fig.2 Microbial life of Roxburgh rose Jiaosu in different regions - diversity box-like diagram

圖2-A反映的是物種的多樣性，圖2-B反映的是物種的豐富度。由圖2-A可知，不同區(qū)域的微生物多樣性差異較大，Shannon結(jié)果表明，銅仁(TR)地區(qū)的酒曲發(fā)酵制備的刺梨酵素具有最高的微生物多樣性，而遵義(ZY)地區(qū)酒曲發(fā)酵制備的刺梨酵素微生物多樣性相對較低；從豐富度方面分析，不同區(qū)域酒曲發(fā)酵的刺梨酵素都具有較高的豐富度，通過比較Observed OTU指數(shù)，銅仁(TR)地區(qū)的酒曲發(fā)酵制備的刺梨酵素具有最高的微生物豐富度，而黔東南(QDN)地區(qū)酒曲發(fā)酵制備的刺梨酵素微生物豐富度相對較低。由圖2-C和圖2-D可知，不同區(qū)域細(xì)菌多樣性和豐富度組間存在一定的差異性，但無顯著性差異(P>0.05)，然而，有研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的酒曲微生物群落構(gòu)成及多樣性存在明顯差異，且酒曲的基本理化指標(biāo)與微生物菌群結(jié)構(gòu)有一定的相關(guān)性[9]，可能是地域特有的環(huán)境和溫度導(dǎo)致的差異性。任海偉等[10]研究發(fā)現(xiàn)溫度會直接影響微生物菌群的動態(tài)變化和多樣性，室溫更有利于提高乳酸發(fā)酵強(qiáng)度，抑制腐敗菌生長，使有機(jī)酸和有機(jī)組分得到優(yōu)化重組，實(shí)現(xiàn)較高貯存品質(zhì)。溫度對微生物的多樣性影響顯著，銅仁地區(qū)常年溫度較高，四季溫差變化較小，適宜微生物生長，造成該地區(qū)較高的微生物多樣性和豐富度，因此選擇適宜穩(wěn)定的發(fā)酵溫度是提高酵素品質(zhì)的關(guān)鍵。

2.4 不同酒曲發(fā)酵的刺梨酵素細(xì)菌微生物群落組成分析

2.4.1 不同區(qū)域酒曲發(fā)酵刺梨酵素在門水平上優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)組成分析

分析不同區(qū)域酒曲發(fā)酵的刺梨酵素菌群在門水平上分布前10的菌群有變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verruco-microbia)、酸桿菌門(Acidobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、螺旋體門(Spirochaetes)、未知細(xì)菌(unspecified_Bacteria)，其中相對豐度>1%的菌群有3種，即變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)。母應(yīng)春等[11]研究了貴州花溪、貴州和安順3個地區(qū)酒曲的微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門、變形菌門、放線菌門的相對豐度在3個地區(qū)酒曲中均較高；另外陳玲等[12]以濃香型白酒大曲為研究對象，基于16S rRNA基因?yàn)槟康钠危捎梦⑸镏讣y圖譜分析技術(shù)16S rDNA克隆文庫法和高通量測序法分析了大曲中細(xì)菌微生物群落的組成，發(fā)現(xiàn)大曲中的微生物主要分布于厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和藍(lán)藻菌門(Cyanobacteria/Chloroplast)4個菌門，由此可知刺梨酵素中微生物菌群的組成與發(fā)酵酒曲密切相關(guān)。進(jìn)一步分析不同區(qū)域中各優(yōu)勢菌群所占的比例，其中畢節(jié)(BJ)地區(qū)酒曲發(fā)酵的刺梨酵素中變形菌門(Proteobacteria)占52.3%，厚壁菌門(Firmicutes)占37.9%，擬桿菌門(Bacteroidetes)占7.2%；貴陽(GY)地區(qū)酒曲發(fā)酵的刺梨酵素中變形菌門(Proteobacteria)占69.2%，厚壁菌門(Firmicutes)占26.7%，擬桿菌門(Bacteroidetes)占2.2%；黔東南(QDN)地區(qū)酒曲發(fā)酵的刺梨酵素中變形菌門(Proteobacteria)占71.8%，厚壁菌門(Firmicutes)占19.5%，擬桿菌門(Bacteroidetes)占7.0%；黔南(QN)地區(qū)酒曲發(fā)酵的刺梨酵素中變形菌門(Proteobacteria)占67.0%，厚壁菌門(Firmicutes)占28.2%，擬桿菌門(Bacteroidetes)占2.0%；黔西南(QXN)地區(qū)酒曲發(fā)酵的刺梨酵素中變形菌門(Proteobacteria)占62.9%，厚壁菌門(Firmicutes)占28.9%，擬桿菌門(Bacteroidetes)占2.7%；銅仁(TR)地區(qū)酒曲發(fā)酵的刺梨酵素中變形菌門(Proteobacteria)占58.4%，厚壁菌門(Firmicutes)占27.7%，擬桿菌門(Bacteroidetes)占7.4%；遵義(ZY)地區(qū)酒曲發(fā)酵的刺梨酵素中變形菌門(Proteobacteria)占69.2%，厚壁菌門(Firmicutes)占27.6%，擬桿菌門(Bacteroidetes)占2.0%。綜上可知，采用酒曲發(fā)酵的刺梨酵素中優(yōu)勢菌群為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)，其中以變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度最高，每個區(qū)域都占到了50%以上，不同區(qū)域各個菌群有一定差異性，但在門水平上差異不顯著。

2.4.2 不同區(qū)域酒曲發(fā)酵刺梨酵素在屬水平上優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)組成分析

在屬水平上，7個區(qū)域酒曲發(fā)酵的刺梨酵素中分布前10的細(xì)菌屬為假單胞菌屬(Pseudomonas)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、未知的胞菌科屬(unspecified_Aeromonadaceae)、葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobacter)、腸球菌屬(Enterococcus)、未知的乳桿菌屬(unspecified_Lactobacillaceae)、未知的腸桿菌屬(unspecified_Enterobacteriaceae)、未知的梭菌屬(unspecified_Clostridiales)、擬桿菌屬(Bacteroides)、普氏菌屬(Prevotella)，其相對豐度如圖3所示。其中相對豐度>10%的菌屬有畢節(jié)(BJ)的假單胞菌屬(Pseudomonas)占28.6%，醋酸桿菌屬(Acetobacter)占17.9%，乳酸菌屬(Lactobacillus)占25.2%，貴陽(GY)的假單胞菌(Pseudomonas)占40.7%，醋酸桿菌屬(Acetobacter)占17.4%，乳酸菌屬(Lactobacillus)占14.8%，黔東南(QDN)地區(qū)的假單胞菌屬(Pseudomonas)占13.0%，醋酸桿菌屬(Acetobacter)占53.8%，乳酸菌屬(Lactobacillus)占8.9%，黔南(QN)地區(qū)的假單胞菌屬(Pseudomonas)占36.2%，醋酸桿菌屬(Acetobacter)占21.7%，乳酸菌屬(Lactobacillus)占20.9%，黔西南(QXN)地區(qū)的假單胞菌(Pseudomonas)占38.3%，醋酸桿菌屬(Acetobacter)占8.4%，乳酸菌屬(Lactobacillus)占11.9%，銅仁(TR)地區(qū)的假單胞菌(Pseudomonas)占43.3%，醋酸桿菌屬(Acetobacter)占6.6%，乳酸菌屬(Lactobacillus)占14.1%，遵義地區(qū)(ZY)的假單胞菌(Pseudomonas)占24.8%，醋酸桿菌屬(Acetobacter)占34.7%，乳酸菌屬(Lactobacillus)占22.2%。

圖3 不同區(qū)域酒曲發(fā)酵刺梨酵素菌群屬水平分布圖Fig.3 Horizontal distribution of flora genus of Roxburgh rose Jiaosu in different regions

由以上分析可知，在屬水平上不同地區(qū)酒曲發(fā)酵的刺梨酵素中已鑒定到的優(yōu)勢菌群為假單胞菌屬(Pseudomonas)、醋酸桿菌屬(Acetobacter)、乳酸菌屬(Lactobacillus)。酵素發(fā)酵過程是由醇和酸共同參與轉(zhuǎn)化的過程，在酶和微生物的作用下將糖類或蛋白質(zhì)直接轉(zhuǎn)化為醇或酸類[13]，厚壁菌門中的乳酸菌屬能夠產(chǎn)酸且在酸度較高的環(huán)境下生長[14]，主要參與了酵素發(fā)酵的生物轉(zhuǎn)化，與酵素中有機(jī)酸的形成密切相關(guān)，乳酸菌是一類具有提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收，維持胃腸道菌群平衡的益生菌[15]。研究表明不同乳酸菌種發(fā)酵對桂圓肉中游離態(tài)、結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)含量、單體酚組成及其抗氧化活性都有影響，乳酸菌能提高桂圓肉中游離態(tài)酚類物質(zhì)含量，降低結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)含量，同時提高其抗氧化能力[16]，因此，乳酸菌代謝對酵素功能的表達(dá)至關(guān)重要。醋酸桿菌屬是酵素發(fā)酵過程中的一大類產(chǎn)酸細(xì)菌，了解醋酸菌屬的組成及發(fā)酵特性有助于合理控制酵素發(fā)酵進(jìn)程，有效提高酵素的風(fēng)味品質(zhì)[17]。另外醋酸桿菌屬(Acetobacter)與葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobacter)也是酵素發(fā)酵過程中產(chǎn)生菌蓋的關(guān)鍵菌群[28]，醋酸和乳酸是酵素風(fēng)味的主要成分，二者存在的酸性條件可影響有機(jī)酸、功能成分的穩(wěn)定性[19]。

2.5 不同酒曲發(fā)酵的刺梨酵素功能成分與菌群屬水平物種RDA分析

分析不同區(qū)域酒曲發(fā)酵刺梨酵素的功能成分，結(jié)果如表1所示。

表1 不同區(qū)域酒曲發(fā)酵刺梨酵素功能成分含量表Table 1 Contents of functional components of Roxburgh rose Jiaosu in different regions

由表1可知,功能成分總?cè)坪蚔C含量存在顯著性差異(P<0.05)，而不同酒曲發(fā)酵的刺梨酵素中總黃酮和糖度的含量差異不顯著。在相同的發(fā)酵條件下，發(fā)酵底物相同，而發(fā)酵劑不同，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物中功能成分含量的改變，因此發(fā)酵劑中微生物與發(fā)酵產(chǎn)物之間可能存在相關(guān)性, 典型相關(guān)分析(canonical correlation analysis，CCA)/RDA排序如圖4所示。

圖4 不同酒曲發(fā)酵的刺梨酵素菌群屬水平物種CCA/RDA排序圖Fig.4 CCA/RDA sequence of flora genus of Roxburgh rose Jiaosu in different regions

RDA物種排序圖內(nèi)，環(huán)境因子用箭頭表示，箭頭連線的長度代表某個環(huán)境因子與群落分布和種類分布間相關(guān)程度的大小(解釋方差的大小)，箭頭越長，說明相關(guān)性越大，反之越小[20]。箭頭連線和排序軸的夾角代表某個環(huán)境因子與排序軸的相關(guān)性大小，夾角越小，相關(guān)性越高，反之越低。環(huán)境因子之間的夾角為銳角時表示2個環(huán)境因子之間呈正相關(guān)關(guān)系，鈍角時呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。每個點(diǎn)代表一個物種，點(diǎn)越大，對應(yīng)物種豐度越高，灰色點(diǎn)代表豐度較低的物種[21]，通過功能因子用箭頭連線的長度代表某個環(huán)境因子與群落分布和種類分布間相關(guān)程度的大小[22]。由圖4可知，刺梨酵素中的功能成分與菌群結(jié)構(gòu)之間存在相關(guān)性，通過圖中原點(diǎn)大小判斷醋酸桿菌屬(Acetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobacter)與刺梨酵素中功能成分的相關(guān)性較大，通過箭頭連線的長度可知VC與菌群的相關(guān)程度最大，功能因子總?cè)坪涂傸S酮之間夾角為銳角，表明2個指標(biāo)之間具有協(xié)同效應(yīng)。而糖度與總?cè)啤⒖傸S酮之間夾角為鈍角，表明糖度與功能因子總?cè)坪涂傸S酮之間呈負(fù)相關(guān)性，由以上結(jié)果可知，刺梨酵素中細(xì)菌菌群組成與其含有的主要功能成分之間存在相關(guān)性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用高通量測序方法對貴州不同區(qū)域酒曲發(fā)酵的刺梨酵素細(xì)菌群落組成和多樣性進(jìn)行分析，比較不同地區(qū)酒曲發(fā)酵刺梨酵素的微生物群落結(jié)構(gòu)差異，探究刺梨酵素中微生物群落與功能因子的相關(guān)性。通過對菌群多樣性分析，貴州省7個區(qū)域酒曲發(fā)酵的刺梨酵素共得到有效序列1 139 057條，平均每個樣品51 775條，α-多樣性分析表明，銅仁(TR)地區(qū)酒曲發(fā)酵制備刺梨酵素的微生物多樣性和豐富度相對其他地區(qū)均較高，而遵義(ZY)地區(qū)多樣性相對較低，黔東南(QDN)地區(qū)豐富度相對較低。從菌群結(jié)構(gòu)組成上分析，醋酸桿菌屬(Acetobacter)、乳酸菌屬(Lactobacillus)作為酵素中的主要微生物；通過RDA分析得出刺梨酵素中細(xì)菌菌群組成與其含有的主要功能成分之間存在相關(guān)性，其中與功能因子相關(guān)的菌群按照相關(guān)性依次為醋酸桿菌屬(Acetobacter)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobacter)。以上結(jié)論能夠?yàn)槿蘸髲木魄泻Y選益生菌作為酵素發(fā)酵劑提供借鑒與參考，同時也為酒曲發(fā)酵刺梨酵素的可行性提供了理論依據(jù)，后期將進(jìn)一步探究不同酒曲在刺梨酵素發(fā)酵過程中微生物的動態(tài)變化，為刺梨酵素的標(biāo)準(zhǔn)化開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。