不同劑量植物油對小鼠腸道微生物、酶活性及血常規的影響

楊曉燕，何云山，譚周進，肖丹，曾鈺婷，曾晨

(湖南中醫藥大學，湖南 長沙，410208)

食用油是日常生活中重要的調味品，由多種脂肪酸混合而成，為人體提供能量和必需脂肪酸，是促進脂溶性維生素吸收的重要成分[1]。按照不飽和程度分類，脂肪酸可大致分為飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)、不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid，UFA)、以及反式脂肪酸(trans fatty acid，TFA)3大類，其中不飽和脂肪酸又可分為單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFA)和多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)。SFA主要來源于動物類油脂，包括丁酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸等[2]，具有調節免疫應答、抑制腫瘤生長、促進細胞分化和凋亡的作用。MUFA是含有一個雙鍵的脂肪酸，廣泛分布于動物脂肪和植物油中，具有保護心臟、降血糖、調節血脂、降低膽固醇等功能[3]。PUFA又叫多烯酸，是含有2個及2個以上雙鍵的脂肪酸。與SFA相比，PUFA具有更多的功效，能降低血液黏稠度，改善血液微循環，增強人體防御系統[4]。PUFA系列繁多，最具生物學意義的是ω-3和ω-6系列，如花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、二十二碳五烯酸(docosapentaenoic acid，DPA)等。TFA主要產生于高溫油炸過程中，對人體健康有著巨大的危害[5]。大部分的脂肪酸無法通過人體自身合成，需要通過食物獲取，因此合理、均衡的油脂攝入有益于機體健康。不同種類的脂肪酸各有優缺點，通過脂肪酸平衡配比能很好地綜合各類油脂的優點，同時彌補各自的缺點[6]。1977年9月世界衛生組織與聯合國糧農組織首次提出有關脂肪酸平衡的概念，部分專家提出MUFA∶PUFA∶SFA=1∶1∶1的脂肪酸平衡比例。“金龍魚”食用植物調和油是在此比例的基礎上研發而出，其SFA∶MUFA∶PUFA=0.27∶1∶1，PUFA(n-6)∶PUFA(n-3)=5∶1，幫助人體脂肪酸達到1∶1∶1的平衡比例，深受廣大消費者的歡迎。《中國居民膳食指南(2007)》建議每人每天油脂的用量應不超過25 g或30 g[6]，然而隨著生活水平的不斷提高，人均每天油脂攝入量已經遠遠超過建議用量，致使心血管疾病、肥胖、脂肪肝等多種慢性病的患病率增加。本研究從腸道微生態的角度來分析不同劑量“金龍魚”食用植物調和油對正常小鼠腸道內可培養微生物以及腸道功能酶的影響，結合血常規等指標，為食用油的合理膳食提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物

6周齡無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級昆明小鼠30只，18～22 g，雌雄各15只，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。動物編號SCXK(湘)2013-0004。

1.1.2 飼料、墊料

普通維持飼料和普通楊木墊料，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.1.3 動物屏障環境

湖南中醫藥大學動物實驗中心(室溫23～25 ℃，相對濕度50%～70%)。設施使用許可證編號SYXK(湘)2019-0009。

1.1.4 培養基

乳酸菌(MRS培養基)、細菌總數(牛肉膏蛋白胨培養基)、雙歧桿菌(BBL培養基)、大腸桿菌(伊紅美藍培養基)、配制參考文獻的方法進行[7]。

1.1.5 試劑

植物油為金龍魚1∶1∶1食用植物調和油：大豆油(49.0%)、菜籽油(23.5%)、葵花籽油(14.0%)、玉米油(9.0%)、稻米油(3.0%)、芝麻油(0.6%)、花生油(0.5%)、胡麻油(0.4%)；羧甲基纖維素鈉、三氯乙酸，國藥集團化學試劑有限公司；干酪素，武漢佰興生物科技有限公司；木聚糖，上海山蒲化工有限公司；淀粉、NaOH，西隴化工股份有限公司；Na2CO3，湖南匯虹試劑有限公司；福林酚，合肥博美生物科技有限責任公司；DNS，實驗室配制。

1.1.6 儀器與設備

手提式壓力蒸汽滅菌鍋，浙江新豐醫療器械有限公司；分光光度計，上海創萌生物科技有限公司；SH2-82氣浴恒溫振蕩器，太原儀城實驗設備有限公司；HHBII.500-s電熱恒溫培養箱，上海博泰實驗設備有限公司；恒溫水浴鍋，上海精密儀器儀表有限公司；CA-500 血液自動分析儀，山東蘭橋醫學科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理

30只昆明小鼠適應性喂養2 d后，采用隨機數字表發分為正常組、A組、B組、C組、D組。正常組灌胃蒸餾水0.2 mL/次，A、B、C、D組分別按6.67 mL/(kg·d)(0.1 mL/次)、13.33 mL/(kg·d)(0.2 mL/次)、20.00 mL/(kg·d)(0.3 mL/次)、26.67 mL/(kg·d)(0.4 mL/次)的劑量灌胃“金龍魚”食用植物調和油，每天2次，間隔8 h，連續30 d。

1.2.2 小鼠腸道指標測定

小鼠腸道內容物的提取、微生物數量的測定、酶活性的分析參照文獻[8-10]的方法進行。

1.2.3 血常規測定

實驗前禁食12 h，禁水1 h，眼球采血1.0～1.5 mL，注入乙二胺四乙酸二鉀(ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt-K2，EDTA-K2)抗凝管中，混勻后，運用CA-500 血液自動分析儀采用阻抗法測定各組小鼠血常規指標。

1.2.4 統計學分析

用SPSS 21.00軟件處理數據，所得數據采用平均值±標準差(x±s)表示，多組均數比較若符合條件則用單因素方差分析，否則采用多組秩和檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同劑量植物油對小鼠腸道微生物的影響

植物油對小鼠腸道微生物的影響見表1。由表1可知，植物油可以顯著降低小鼠腸道細菌總數和大腸桿菌數(P<0.05)，而細菌總數在不同劑量植物油組間差異不顯著(P>0.05)，大腸桿菌數除A組和C組無顯著差異外(P>0.05)，其余劑量的植物油組間均存在顯著性差異(P<0.05)。從乳酸菌數來看，低劑量組(A組)和高劑量組(D組)能顯著降低正常小鼠腸道內乳酸菌數P<0.05)，而中劑量組(B、C組)則能升高正常小鼠腸道乳酸菌數，但與正常組比，升高的幅度與正常組小鼠相比差異不顯著(P>0.05)。雙歧桿菌數也表現出類似的規律，低劑量組(A組)能降低小鼠雙歧桿菌數，中劑量組則能升高正常小鼠雙歧桿菌數，2組雙歧桿菌數與正常組差異顯著(P<0.05)。綜合分析4種可培養腸道微生物，提示適當攝入植物油能增加有益菌的數量，減少大腸桿菌等條件致病菌的數量。

表1 不同劑量植物油對小鼠腸道微生物的影響Table 1 Effects of different doses of vegetable oil on intestinal microorganisms in mice

2.2 不同劑量植物油對小鼠腸道酶活性的影響

如圖1所示，與正常組比，A組的4種腸道酶活性均升高，差異顯著(P<0.05)。就蛋白酶而言，正常組的蛋白酶活顯著低于植物油攝入組(P<0.05)，其中C組的蛋白酶活最高，與其他各組差異顯著(P<0.05)。C組的纖維素酶活與其他各組比差異不顯著(P>0.05)；A組的纖維素酶活最高，顯著高于正常組、植物油B組及D組(P<0.05)；與A組纖維素酶活變化相反，B組及D組的纖維素酶活顯著低于正常組(P<0.05)。除B組的木聚糖酶與正常組比無差異外，其余各組與正常組比均差異顯著(P<0.05)。與纖維素酶相似，木聚糖酶活在植物油A組最高，顯著高于其他各組(P<0.05)，而C組及D組木聚糖酶活顯著低于正常組和B組(P<0.05)。植物油D組的木聚糖酶活性顯著高于植物油C組(P<0.05)。與正常組比，A組、B組的淀粉酶活性顯著升高(P<0.05)，而C組顯著降低(P<0.05)；A組的淀粉酶活與其他各組均具有顯著差異(P<0.05)；植物油B組的淀粉酶活顯著高于C組、D組(P<0.05)。

圖1 不同劑量植物油對小鼠腸道酶活性的影響Fig.1 Effect of different doses of vegetable oil on intestinal enzyme activity in mice注：同種酶中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 不同劑量植物油對小鼠紅細胞的影響

紅細胞(red blood cells，RBC)是機體運輸氧氣的主要媒介物質，同時還有一定的免疫功能。紅細胞分布寬度(red blood cell distribution width，RDW)是反映紅細胞體積變化大小的變異性指標系數，紅細胞的平均體積(mean corpuscular volume，MCV)降低常見于小細胞低色素貧血和全身性溶血性貧血，因此RDW和MCV常用于貧血的輔助診斷[11]。紅細胞比容(hematocrit value，HCT)是血液黏度的主要決定因素，與冠心病、高血壓病、冠狀動脈慢回流等多種心血管疾病有著密切的聯系[12]。由圖2可知，不同劑量的植物油對RBC、HCT、MCV及RDW的影響均無統計學意義(P<0.05)。但仔細分析HCT、MCV以及RDW的變化，不難發現植物油組的HCT和RDW略微高于正常組，HCT的提高提示油脂對心血管疾病有著潛在的風險，而RDW的升高則提示紅細胞的形態出現異常。研究指出RDW水平較高的人群存在著更高的心血管不良預后風險[13]。綜上可知，植物油對機體紅細胞的影響可能是長期、慢性的，高油脂的攝入會使患心血管疾病的風險增加。

圖2 不同劑量植物油對小鼠紅細胞的影響Fig.2 Effect of different doses of vegetable oil on red blood cells of mice

2.4 不同劑量植物油對小鼠血小板的影響

血小板是機體正常凝血機制中的關鍵成分，其質量與數量反映骨髓造血功能和凝血功能狀態[14]。血小板的參數由血小板計數(platelet count，PLT)、血小板比容(thrombocytocrit，PCT)、血小板平均體積(mean platelet volume，MPV)以及血小板體積分布寬度(platelet distribution width，PDW)組成，血小板參數的變化可以間接反映機體骨髓造血功能。李月等[15]研究發現，PDW值與血小板活化呈正相關，可作為新型血小板活化特異性標志物的評價。由圖3可知，較大劑量的植物油能減少PLT和PCT，升高MPV和PDW值，但與正常組相比差異不顯著(P>0.05)，并且不同劑量植物油組間的差異也不顯著。從這些變化中得知，PDW值與血小板活化呈正相關，而血小板活化是血栓形成的重要環節，因此攝入油脂過多容易引發血栓。

圖3 不同劑量植物油對小鼠血小板的影響Fig.3 Effects of different doses of vegetable oil on platelets in mice

2.5 不同劑量植物油對小鼠血紅蛋白的影響

血紅蛋白(hemoglobin，HGB)具有維持血液酸堿平衡以及運輸氧和二氧化碳的功能。如圖4所示，不同劑量植物油對正常小鼠的HGB、平均血紅蛋白量(mean corpuscular hemoglobin，MCH)、平均血紅蛋白濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC)無顯著性差異(P>0.05)，提示植物油對機體的血紅蛋白基本無影響。

圖4 不同劑量植物油對小鼠血紅蛋白的影響Fig.4 Effect of different doses of vegetable oil on hemoglobin in mice

2.6 不同劑量植物油對小鼠白細胞的影響

白細胞對防止機體損傷和抵御病原體的侵入具有重要作用，主要包括粒細胞、單核細胞和淋巴細胞。如表2所示，低、中劑量植物油對正常小鼠的淋巴細胞(lymphocyte，LYM)以及中性粒細胞(granulocyte，GRA)并無顯著影響，而高劑量植物油使小鼠的LYM數顯著降低(P<0.05)，GRA值顯著升高(P<0.05)，提示我們高劑量的植物油能破壞機體的免疫功能。單核細胞方面，不同劑量植物油對正常小鼠的單核細胞百分比無顯著影響，且植物油組間的單核細胞百分比數值也無較大差異(P>0.05)。

表2 不同劑量植物油對小鼠白細胞的影響Table 2 Effects of different doses of vegetable oil on mouse leukocytes

3 討論

油脂攝入不當容易導致肥胖、胰島素抵抗、非酒精性脂肪肝、動脈粥樣硬化等代謝性疾病，腸道菌群在代謝性疾病的發生發展中發揮著重要的作用[16-17]。小腸是脂肪吸收的主要部位，當機體攝入過多的脂肪，容易導致腸道組織發生氧化應激[18]。正常情況下，機體內的活性氧與抗氧化系統處于一個平衡的狀態，而過多的油脂攝入會導致線粒體電子傳遞鏈過載，造成活性氧生成增多，導致機體產生的活性氧超過機體抗氧化能力[19-20]。當腸道中超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫等氧化應激產物增加時，會改變腸道內的微環境，造成腸道菌群的紊亂[21]。本研究結果顯示，植物油的攝入能顯著降低小鼠腸道細菌總數和大腸桿菌數，B組或C組能使小鼠腸道內乳酸菌和雙歧桿菌數得以保持或略微提高。這種變化可從腸道組織氧化應激這一角度加以解釋，當腸道發生氧化應激時，導致腸道內細菌總數和大腸桿菌數顯著降低，腸道微生態遭到破壞。而益生菌(乳酸菌和雙歧桿菌)的增殖能夠對氧化應激所產生的氧化應激物起到一定的抑制作用[22]，減輕腸道炎癥，并且由于腸道菌群相互制約的關系，益生菌的增多也會在一定程度上影響大腸桿菌等條件致病菌的數目。隨氧化應激產物增加，會對益生菌起到破壞作用，這可能是D組乳酸菌數下降的原因。二者之間的具體關系有待進一步量化研究。腸道pH值也是影響腸道菌群的一個重要影響因素，食用油的主要成分為脂肪酸，在一定程度上能夠降低腸道pH值，有益于乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌的生長。

腸道消化酶是機體腸道內重要組成部分，影響著機體營養物質吸收、免疫以及生長發育等[23]。腸道消化酶的來源主要有腸道菌群、機體分泌及外界攝入，其活性受腸道pH值、鹽度、溫度、食性等多種腸道理化因素的影響[24]。鄭淘等[25]通過給小鼠灌胃不同濃度的咖啡，持續30 d，結果發現適量飲用咖啡能顯著提高小鼠腸道淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、木聚糖酶等的活性。范觀宇等[26]用10%、20%和30% (體積分數)的酒精水溶液作為小鼠的唯一飲用水，持續1個月，發現30%的酒精水溶液對小鼠腸道內淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、木聚糖酶等的活性具有顯著提高作用。本研究結果顯示，低劑量的植物油攝入量能顯著提高蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶以及淀粉酶等的活性，而隨著劑量的增加，部分腸道功能酶的活性受到抑制。課題組在前期的研究中發現高脂飲食小鼠腸道內木聚糖酶、淀粉酶以及蛋白酶顯著提高[27]，并且特制飼料(高蛋白、高熱量飼料)誘導的食積小鼠內相應的腸道功能酶較正常組相比也顯著提高[28]。王朝明等[29]利用不同脂肪水平試驗飼料飼喂胭脂魚，結果發現隨著飼料脂肪水平增加，蛋白酶活性逐漸降低。本次實驗的4種酶也表現出類似的規律，高劑量攝入植物油的小鼠體內多種酶活顯著低于正常組。可能與當小鼠體內油脂含量較低時，小鼠通過增加對蛋白質和碳水化合物的消化吸收能力來維持其正常的生命活動有關。而當油脂含量升高時，會降低其對蛋白質和碳水化合物的依賴能力，致使蛋白酶和淀粉酶活下降。再者，高劑量植物油組的小鼠細菌總數顯著下降，在一定程度上也能反映纖維素酶和木聚糖酶活的下降[26]。

不同劑量植物油對正常小鼠的紅細胞、血小板、血紅蛋白以及白細胞等指標基本無影響，僅有D組的淋巴細胞百分比、中性粒細胞百分比與正常組比差異顯著。但這些結果并不支持食用油對機體的血常規無影響，食用油對機體的影響可能是長期的、慢性的，本實驗時長僅1個月，食用油對小鼠血常規各項指標還不足以造成影響。仔細分析發現攝入高劑量食用油組小鼠HCT、RDW、MCV、MPV、PDW等指標值升高，而這些指標與冠心病、高血壓病、冠狀動脈慢回流等多種心血管疾病有著密切的聯系。提示我們長期高脂飲食會使患各種心血管疾病的風險增加。此外從HGB、MCH、MCHC等值變化提示我們高脂飲食容易導致機體出現貧血、血液運輸能力減弱。這一影響也可從氧化應激的角度得以解釋，超氧陰離子能夠與一氧化氮迅速形成過氧硝酸鹽，減少血漿NO的水平，使血管功能出現障礙[30]。當攝入大量的食用油，容易造成血液中游離脂肪酸增多，脂肪酸能夠刺激巨噬細胞的炎癥過程，導致血栓的進一步形成[31]。

4 結論

通過分析不同劑量植物油對正常小鼠可培養微生物、腸道功能酶以及血常規的影響發現低劑量的植物油能顯著提高腸道功能酶的活性，促進消化。中劑量的植物油雖然能增加有益菌的數量，但部分腸道功能酶的活性下降。而高劑量的攝入植物油容易導致腸道有益菌的數目下降，腸道功能酶的活性下降，并且血常規中多種與心血管疾病相關的指標出現異常。整體而言，適當的攝入植物油有助于提高機體的消化能力、減少炎癥，預防心血管疾病的發生。