響應(yīng)面法優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵制備羅非魚皮膠原蛋白的工藝

邢瀚文，韓瑋，施文正,2,3，李曉暉,2,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)3(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海，201306)

膠原蛋白是脊椎動(dòng)物體內(nèi)重要的蛋白質(zhì)，約占總蛋白質(zhì)量的25%，通常用于支撐、保護(hù)器官和身體[1]。目前膠原蛋白可作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、食用保鮮膜、皮膚替代物和生物膜等的原料[2-5]，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等多種領(lǐng)域。近年來(lái)，由于宗教問(wèn)題及瘋牛病、口蹄疫等傳染病的流行率增加，使陸生動(dòng)物膠原蛋白的應(yīng)用受限。研究表明，魚膠原蛋白在組織應(yīng)用工程中可以代替牛膠原蛋白[6]。另外，由于氨基酸組成和交聯(lián)度等方面的差異使得水生動(dòng)物膠原蛋白具有更低的抗原性和致敏性[7]。

羅非魚是中國(guó)重要的養(yǎng)殖魚類，然而在其加工中產(chǎn)生的魚鱗、魚皮等副產(chǎn)物通常被丟棄或制成廉價(jià)飼料，因此，如何對(duì)這部分資源實(shí)現(xiàn)高值化利用，已成為羅非魚產(chǎn)業(yè)面臨的關(guān)鍵問(wèn)題。羅非魚皮中的膠原蛋白含量較高[8]，這為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供了可能。

目前，膠原蛋白的提取多采用酸法、熱水法、堿法等傳統(tǒng)方法。然而，考慮到產(chǎn)品品質(zhì)、生產(chǎn)成本和環(huán)境污染等問(wèn)題，這些提取方法存在諸多局限性。發(fā)酵法可將去除魚皮中雜蛋白和脂肪與提取膠原蛋白通過(guò)加菌發(fā)酵一個(gè)程序完成，極大地簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。由于微生物產(chǎn)生的胞外蛋白酶和脂肪酶的作用，在提取過(guò)程中無(wú)需使用化學(xué)試劑和昂貴的酶制劑，不僅能夠減少環(huán)境污染，而且使膠原蛋白的生產(chǎn)成本得以降低[9]。另外，通過(guò)微生物發(fā)酵還可以去除魚皮中的腥臭味從而提高樣品的感官質(zhì)量[10]。實(shí)驗(yàn)證明，液態(tài)發(fā)酵法制備魚皮膠原蛋白的得率遠(yuǎn)高于酸法、熱水法和堿法[11]。固態(tài)發(fā)酵(soild-state fermentation，SSF)與液態(tài)發(fā)酵相比，其成本低、產(chǎn)物濃度高、能耗低，且有利于菌體次生代謝，已被用于生產(chǎn)一系列高附加值產(chǎn)品，如乳酸、木質(zhì)素酶、抗氧化肽[12-14]等。

本研究以羅非魚皮為原料，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件以獲得最佳發(fā)酵工藝，并將SSF膠原蛋白與酸溶性膠原蛋白(acid-soluble collagen，ASC)的結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行分析比較，旨在為膠原蛋白的新型生產(chǎn)途徑和羅非魚皮的深入開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚魚皮，雷州市龍之潤(rùn)水產(chǎn)品有限公司；菌種BacillussubtilisCCTCC AB 90008，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，青島海博生物有限公司；L-羥脯氨酸(純度99%)，Sigma公司；其他試劑均為分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Heraeus Pico 17高速離心機(jī)、Nicolet iS50傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；UV-1800 PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；DYCZ-25D型雙垂直電泳儀、DYY-6D型電腦三恒多用電泳儀電源，北京六一生物科技有限公司；L-8800氨基酸自動(dòng)分析儀，日本Hitachi公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚皮的預(yù)處理

將魚皮去鱗、除雜，用蒸餾水洗凈后充分瀝干，切分成約1 cm×1 cm的碎塊并經(jīng)打粉機(jī)粉碎，冷凍至-20 ℃，備用。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵法提取膠原蛋白

將BacillussubtilisCCTCC AB 90008從甘油保藏管接入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，將活化好的菌種接至種子培養(yǎng)基(牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.2～7.4)中，于37 ℃、120 r/min培養(yǎng)一定時(shí)間，制得種子液。將10 g處理好的魚皮裝入250 mL錐形瓶中，121 ℃高溫滅菌20 min，在無(wú)菌條件下加入一定量的滅菌去離子水(pH自然)，作為固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。按比例接入培養(yǎng)好的發(fā)酵種子液，恒溫靜置培養(yǎng)，并每隔5 h搖瓶翻動(dòng)1次，相應(yīng)的發(fā)酵條件按照單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)施。

發(fā)酵結(jié)束后，將殘留物用去離子水定容至100 mL，于4 ℃浸提2 h，過(guò)濾，于10 000 r/min離心15 min。收集上清液，鹽析至最終濃度為0.9 mol/L，在10 000 r/min的條件下離心20 min，收集沉淀并將其完全溶于0.5 mol/L的乙酸溶液，于0.1 mol/L的乙酸溶液(體積比1∶20)中透析20 h，隨后在相同體積的去離子水中透析24 h。將透析后的樣品液進(jìn)行真空冷凍干燥，得到SSF膠原蛋白。

1.3.3 酸法提取膠原蛋白

將處理好的魚皮與0.5 mol/L乙酸溶液(體積比1∶20)混合提取24 h。提取液于10 000 r/min離心15 min，收集上清液，后續(xù)制備ASC樣品的步驟同SSF膠原蛋白。

1.3.4 膠原蛋白提取率的測(cè)定

采用WOESSNE比色法[15]測(cè)定樣品中羥脯氨酸的含量。膠原蛋白提取率的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：Y，膠原蛋白提取率，%；m，樣品中羥脯氨酸質(zhì)量，g；11.1，水生動(dòng)物中羥脯氨酸與膠原蛋白的換算系數(shù)；M，發(fā)酵魚皮質(zhì)量，g。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

以膠原蛋白提取率為指標(biāo)，先后考察菌齡、加水量、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間5個(gè)因素對(duì)枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵制備魚皮膠原蛋白工藝的影響。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取加水量、接種量、發(fā)酵溫度作為3個(gè)參考因素，以膠原蛋白提取率為響應(yīng)因子，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜掃描

參考ISWARIYA等[16]的方法略作改動(dòng)：分別取適量膠原蛋白凍干樣品與干燥的KBr于瑪瑙研缽中研磨均勻、裝樣、手動(dòng)壓片，在4 000～500 cm-1進(jìn)行檢測(cè)，分辨率為1 cm-1。

1.3.8 紫外光譜掃描

參考WANG[17]的方法略作改動(dòng)：將凍干的樣品溶于0.5 mol/L的乙酸溶液，配制成1 g/L的膠原蛋白溶液，0.5 mol/L的乙酸溶液作為空白對(duì)照。在200～400 nm近紫外光區(qū)對(duì)膠原蛋白溶液進(jìn)行掃描。

1.3.9 聚丙烯酰胺凝膠電泳

參考LAEMMLI[18]的方法略作改動(dòng)：將純化的膠原蛋白樣品用0.1 mol/L的乙酸溶液配制成10 g/L的膠原蛋白溶液，與上樣緩沖液混合煮沸3 min后冷卻，4 000 r/min離心5 min后取10 μL溶液上樣。電泳使用8%分離膠和5%濃縮膠，采用直流穩(wěn)定電源，濃縮膠電壓為80 V，進(jìn)入分離膠后電壓加至120 V。電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250溶液對(duì)凝膠染色90 min，隨后脫色。

1.3.10 氨基酸分析

采用GB 5009.124—2016[19]的方法，測(cè)定分析樣品中氨基酸含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 18、Origin 8.5和 Design-Expert 10等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 菌齡對(duì)膠原蛋白提取率的影響

在加水量8 mL、接種量4%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間44 h的發(fā)酵條件下，考察接入不同菌齡(14、16、18、20、22、24 h)的種子液對(duì)膠原蛋白提取率的影響。如圖1所示，隨著接入不同菌齡的種子液，膠原蛋白的提取率也相應(yīng)改變。菌種培養(yǎng)14～20 h時(shí)提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)菌齡為20 h時(shí)的提取率達(dá)到最高，此后繼續(xù)培養(yǎng)則菌種開(kāi)始衰退，導(dǎo)致膠原蛋白提取率呈下降趨勢(shì)。故本試驗(yàn)選擇20 h為菌種最佳培養(yǎng)時(shí)間。

圖1 菌齡對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of cell age on the extraction rate of collagen

2.1.2 加水量對(duì)膠原蛋白提取率的影響

以2.1.1確定的最佳菌齡20 h為基礎(chǔ)，在接種量4%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間44 h的條件下，考察不同加水量(4、8、12、16、20 mL)對(duì)膠原蛋白提取率的影響。固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)基中的含水量不但會(huì)影響菌體對(duì)水分的吸收，而且還會(huì)影響菌體對(duì)氧的吸收，因此適合的含水量是發(fā)酵的重要條件。如圖2所示，隨著含水量增加，膠原蛋白提取率先升高后降低，當(dāng)加水量為12 mL時(shí)提取率達(dá)到最高。故本試驗(yàn)選取最佳加水量為12 mL。

圖2 加水量對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of water addition on the extraction rate of collagen

2.1.3 接種量對(duì)膠原蛋白提取率的影響

以上述實(shí)驗(yàn)中確定的最佳菌齡20 h、加水量12 mL為基礎(chǔ)，在發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間44 h的條件下，考察不同接種量(2%、4%、6%、8%、10%、12%)對(duì)膠原蛋白提取率的影響。如圖3所示，當(dāng)接種量<6%時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)足夠支持菌體旺盛的代謝，此時(shí)發(fā)酵水平較高，接種量>6%時(shí)，菌體生長(zhǎng)消耗大量營(yíng)養(yǎng)成分且代謝廢物增多，導(dǎo)致發(fā)酵水平降低，膠原蛋白提取率逐漸降低。故本試驗(yàn)選擇6%為最佳接種量。

圖3 接種量對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of inoculum size on the extraction rate of collagen

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

以上述實(shí)驗(yàn)中確定的最佳菌齡20 h、加水量12 mL、接種量6%為基礎(chǔ)，在發(fā)酵時(shí)間44 h的條件下，考察不同發(fā)酵溫度(20、25、30、35、40 ℃)對(duì)膠原蛋白提取率的影響。溫度是影響菌體發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一，溫度過(guò)低會(huì)減慢菌體的繁殖和代謝，過(guò)高又會(huì)抑制其生長(zhǎng)，都會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白提取率產(chǎn)生變化。如圖4所示，發(fā)酵溫度為20～35 ℃時(shí)膠原蛋白的提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)提取率達(dá)到最高，繼續(xù)升溫則提取率逐漸降低。故本試驗(yàn)選擇35 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on the extraction rate of collagen

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

以上述實(shí)驗(yàn)中確定的最佳菌齡20 h、加水量12 mL、接種量6%、發(fā)酵溫度35 ℃為基礎(chǔ)，考察不同發(fā)酵時(shí)間(36、40、44、48、52、56 h)對(duì)膠原蛋白提取率的影響。如圖5所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原蛋白提取率逐漸增加，在48 h之后提取率增加趨勢(shì)近于平緩，綜合考慮成本和生產(chǎn)效率，本試驗(yàn)選取48 h為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of fermentation time on the extraction rate of collagen

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

參考單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)原理設(shè)計(jì)方案，選取加水量(A)、接種量(B)、發(fā)酵溫度(C)3個(gè)影響較顯著的因素，以膠原蛋白提取率(Y)為響應(yīng)因子，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and values of Box-Behnken experiments

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

對(duì)表2中17組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元擬合回歸分析，得到加水量(A)、接種量(B)、發(fā)酵溫度(C)對(duì)膠原蛋白提取率(Y)影響的多元二次回歸方程為：Y=64.31-1.97A-1.45B-3.44C+0.72AB-3.17AC-0.34BC-11.03A2-6.68B2-10.45C2。

回歸模型的方差分析結(jié)果如表3所示，此模型P<0.01，差異較為顯著，失擬項(xiàng)P>0.05不顯著，表示模型對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合度較高。決定系數(shù)R2=0.968 5，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有96.85%來(lái)源于所選的3個(gè)變量。逐項(xiàng)顯著性結(jié)果檢驗(yàn)表明,3個(gè)因素對(duì)膠原蛋白提取率影響程度分別為C>A>B，且C的P<0.01，表明發(fā)酵溫度對(duì)膠原蛋白的提取率影響較為顯著。交互項(xiàng)AC的P<0.05，表明加水量和發(fā)酵溫度的交互作用對(duì)膠原蛋白提取率具有顯著影響。二次項(xiàng)A2、C2的P<0.000 1，說(shuō)明加水量和發(fā)酵溫度的二次項(xiàng)對(duì)提取率的影響極顯著。

對(duì)回歸方程進(jìn)行分析計(jì)算得出固態(tài)發(fā)酵提取膠原蛋白的最優(yōu)工藝為菌齡20 h，加水量11.71 mL，接種量5.78%，發(fā)酵溫度34.24 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h，此時(shí)膠原蛋白的提取率預(yù)測(cè)值為64.72%。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的可靠性，同時(shí)考慮實(shí)際操作，將最優(yōu)工藝條件修改為菌齡20 h，加水量11.7 mL，接種量5.8%，發(fā)酵溫度34 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h。按照該條件進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，測(cè)得膠原蛋白提取率為65.03%，與預(yù)測(cè)值接近，證明該模型具有可行性與準(zhǔn)確性。

2.3 膠原蛋白提取率的比較

羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸，一般通過(guò)測(cè)量羥脯氨酸含量來(lái)計(jì)算膠原蛋白的提取率。根據(jù)公式(1)得到ASC的提取率為57.26%。在最佳條件下，SSF膠原蛋白的提取率為65.03%，表明固態(tài)發(fā)酵法的提取效率更高。

2.4 傅里葉變換紅外光譜分析

圖6 SSF膠原蛋白和ASC的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.6 Fourier transform infrared spectra of SSF collagen and ASC

2.5 紫外光譜分析

圖7 SSF膠原蛋白和ASC的紫外吸收光譜Fig.7 Ultraviolet spectra of SSF collagen and ASC

2.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

由圖8可知，2種方法所提取的羅非魚皮膠原蛋白均含2條α鏈(α1與α2)和1條β鏈，符合Ⅰ型膠原蛋白的特征[26]。在相對(duì)分子質(zhì)量為130和110 kDa附近分別出現(xiàn)α1鏈和α2鏈，在200 kDa附近出現(xiàn)α鏈，說(shuō)明膠原蛋白分子中存在分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)作用[27]。與ASC相比，SSF膠原蛋白中的α鏈含量有所降低，α鏈以下出現(xiàn)較多低分子電泳條帶，可能是因?yàn)樵诠虘B(tài)發(fā)酵提取過(guò)程中，膠原酶的作用使部分膠原蛋白降解為小分子組分所造成。

1-Marker；2-ASC；3-SSF膠原蛋白圖8 SSF膠原蛋白和ASC的電泳圖譜Fig.8 Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis patterns of SSF collagen and ASC

2.7 氨基酸組成分析

由表4可知，2種羅非魚皮膠原蛋白的氨基酸組成符合天然膠原蛋白的基本特征，即富含甘氨酸(約占總氨基酸質(zhì)量1/3)、丙氨酸和脯氨酸，而蛋氨酸、異亮氨酸、酪氨酸和組氨酸的濃度均較低，色氨酸和半胱氨酸未檢測(cè)出。羅非魚皮ASC的亞氨基酸含量為183.5/1 000個(gè)殘基。羅非魚皮SSF膠原蛋白的亞氨基酸含量(221.7/1 000個(gè)殘基)高于報(bào)道的鱸魚皮(195/1 000個(gè)殘基)[28]和軍曹魚皮(203/1 000個(gè)殘基)[29]。脯氨酸和羥脯氨酸的吡咯烷環(huán)可加強(qiáng)多肽鏈的構(gòu)象限制，能夠穩(wěn)固膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)，與其熱穩(wěn)定性相關(guān)，故羅非魚皮SSF膠原蛋白由于亞氨基酸含量較高，可能表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性[30-31]。

表4 SSF膠原蛋白和ASC的氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of SSF collagen and ASC

3 結(jié)論

本研究以羅非魚魚皮為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵提取膠原蛋白的工藝。綜合考慮實(shí)際操作，將最佳發(fā)酵工藝條件定為菌齡20 h，加水量11.7 mL，接種量5.8%，發(fā)酵溫度34 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h，在此條件下膠原蛋白提取率可達(dá)65.03%，且與模型預(yù)測(cè)值基本吻合，說(shuō)明使用該模型優(yōu)化制備工藝較為準(zhǔn)確有效。傅里葉變換紅外光譜結(jié)果顯示，羅非魚皮經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制備的膠原蛋白仍能保持其完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)。紫外光譜掃描結(jié)果顯示，SSF膠原蛋白在232 nm處有最大紫外吸收特征峰。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示ASC與SSF膠原蛋白均具有β鏈，α1鏈和α2鏈3種條帶，表明2種方法所提取的蛋白均為典型的Ⅰ型膠原蛋白。氨基酸組成表明,SSF膠原蛋白存在特征氨基酸，并具有潛在的抗氧化和降血壓活性。以上分析結(jié)果表明，固態(tài)發(fā)酵法制備的羅非魚皮膠原蛋白具有典型的膠原蛋白特性，且與常規(guī)酸法提取的ASC性質(zhì)相似，表明其有代替ASC進(jìn)行研究和應(yīng)用的可能。該工藝建立了一種新型、環(huán)保、高效的從羅非魚副產(chǎn)物中分離膠原蛋白的生物技術(shù)，所提出的發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定，為生產(chǎn)水生生物膠原蛋白提供了新的思路和工業(yè)化的理論支持。