微酸性電解水對黃豆發芽的影響

趙之怡，申盼盼，張運龍，施丹，李昂，石藝琦，張春玲

(西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌，712100)

黃豆芽是黃豆在適宜環境條件下發芽得到的蔬菜。與種子相比，發芽可以提高VC、黃酮類化合物和蛋白質等營養物質的含量，同時可以降低一些抗營養因子的影響，促進消化吸收[1-2]。豆芽生長周期短，全年均可生產，生產方便快捷，深受廣大生產者和消費者的歡迎。然而，黃豆在發芽、收獲、包裝、運輸和銷售等各個環節中都有可能被來源于人類、動物或環境的微生物污染，如果未被合理消毒，污染微生物會在種子發芽所需的高溫高濕環境中快速生長繁殖，造成豆芽的生產失敗甚至食源性疾病的暴發[3]。目前，輻照、有機酸、次氯酸鈉、熱處理、酒精處理等微生物控制方法被應用于芽苗菜生產[3-6]，但這些方法主要是在種子浸泡或清洗階段用于種子消毒，但浸泡、清洗階段的殺菌消毒無法完全滅活種子攜帶的微生物，在發芽期間如果不采取控制措施，殘留的微生物在高溫高濕的發芽環境中會迅速生長繁殖，最終數量達到較高水平；次氯酸鈉、酒精等高濃度消毒劑的使用將導致化學殘留并影響種子的正常發芽。因此，尋求一種既能有效控制微生物數量，又不影響豆芽生長和食用安全的消毒方法勢在必行。

微酸性電解水(slightly acidic electrolyzed water, SAEW)是在無隔膜的電解槽中電解稀鹽或稀HCl溶液生成的具有特殊理化性質的水溶液，pH為5.0～6.5，具有較強的殺菌活性。相比其他化學消毒劑，SAEW的制備只需簡單的電解過程，無需復雜操作、制取方便、成本低廉；SAEW的有效氯成分易分解，pH接近中性，化學殘留小，對人體、設備、環境的影響小；在微酸性pH范圍內，SAEW中的有效氯成分主要以HClO形式存在，其殺菌效力為ClO-的80～150倍，且SAEW殺菌過程的作用時間短，不利于微生物抗性的形成，殺菌高效、廣譜。研究表明，SAEW對純培養的大腸桿菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、綠膿假單胞菌都有較強的殺滅能力[7-8]。經過SAEW處理，新鮮蔬菜(如芹菜、香菜、藕)和多種芽苗菜(如豌豆芽、綠豆芽、蕎麥芽)的微生物數量均顯著下降[9-13]。因其殺菌高效廣譜、價格低廉、安全環保等特點，SAEW被廣泛應用于食品工業，日本、美國、韓國已經批準SAEW為食品添加劑[12-13]。因此，本研究將SAEW代替常規生產用水用于黃豆發芽過程。

植物生長環境中的離子種類和濃度會對植物造成不同程度的影響，研究表明，在含有一定量Na+的環境中發芽，可以提高西蘭花芽和花椰菜芽的抗氧化活性[14]、提高苦蕎芽的營養價值[15]。因此，本研究利用不同電解質(NaCl和HCl溶液)電解生成含有Na+和不含有Na+的SAEW，并將其應用到黃豆的清洗、浸泡、發芽過程，考察不同SAEW的殺菌效果，以及其對黃豆發芽特性、黃豆芽生長品質和營養物質含量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平板計數瓊脂(plate count agar, PCA)、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violet red bile agar, VRBA)、孟加拉紅瓊脂(rose bengal agar)，北京陸橋技術有限公司；NaCl、HCl均為分析純，四川西隴化工有限公司；抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)含量測試盒、植物類黃酮測試盒，南京建成生物工程研究所；黃豆種子[(17.23±0.04)g/100粒]，陜西省楊凌區好又多超市。

1.2 儀器與設備

Chlorometer Duo雙量程氯量計，英國Palintest公司；Harmony-II微酸性電解水生成設備，北京睿安德科技有限公司；HD-240L微酸性電解水生成設備，上海富強旺衛生用品有限公司；DH-11L拍打式無菌均質機，寧波洛尚智能科技有限公司；Five Easy Plus FE28雙標度pH/ORP計，Mettler Toledo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 SAEW的制備

為比較不同電解質產生的不同有效氯濃度(available chlorine concentrations, ACC)的SAEW對黃豆發芽的影響，本研究以實驗室前期研究所采用的參數為基礎[12]，由發生器1(Harmony-II，電解質60 g/L NaCl)和發生器2(HD-240L，電解質60 g/L HCl)制備ACC為35、70 mg/L的SAEW，在制備完成后立即檢測其理化參數。ACC由氯量計測定。pH和氧化還原電位(oxidation-reduction potential, ORP)由雙標度pH/ORP計測量。本研究所用處理溶液的理化參數如表1所示。

表1 處理溶液的理化參數Table 1 The physicochemical parameters of the treatment solutions

注: CK指自來水，NaCl 70、NaCl 35、HCl 70和HCl 35指電解NaCl或HCl溶液得到的ACC分別為70 mg/L或者35 mg/L 的SAEW

1.3.2 浸種與發芽

剔除蟲蛀、干癟、畸形、超小粒黃豆。每組稱取黃豆200 g，用200 mL相應溶液輕柔清洗，棄去清洗液，重復3次。將清洗過的種子在600 mL相應溶液中浸泡12 h，棄去浸泡液，將種子置于發芽筐(直徑16 cm)中，覆蓋8層無菌紗布，避光發芽。每天用相應處理溶液淋洗5次，第4天收獲。收獲后黃豆芽置于4 ℃冰箱暫存。

1.3.3 微生物分析

采用平板菌落計數法檢測黃豆發芽過程中的微生物數量。黃豆發芽期間，每天在第1次淋水后3 h隨機采樣25 g，置于無菌自封袋。自封袋中加入100 mL質量濃度為8.5 g/L NaCl溶液，以12次/s的速度在均質機中均質2 min以充分洗脫樣品表面微生物，充分混勻后取1 mL均質液進行梯度稀釋。取稀釋梯度合適的菌液0.1 mL，分別涂布于PCA平板、VRBA平板和孟加拉紅瓊脂平板，PCA平板置于37 ℃培養48 h，VRBA平板置于37 ℃培養24 h，孟加拉紅平板置于28 ℃培養72 h。培養結束后分別進行菌落總數、大腸菌群、霉菌和酵母計數，記錄為3次重復測定的平均值，以lg CFU/g表示。本實驗采用的平板菌落計數法的檢出限為1.70 lg CFU/g，即結果表示為無法檢出或0時，表示微生物數<1.70 lg CFU/g。

1.3.4 黃豆的發芽特性

將150粒黃豆按照1.3.2方法清洗、浸泡12 h后瀝干水分，平鋪于濾紙靜置10 min。測定浸泡前后黃豆的質量。吸水率按公式(1)計算：

(1)

式中：W1為樣品浸泡前黃豆質量，g；W2為樣品浸泡后黃豆質量，g。

在直徑18 cm的培養皿底部鋪1層濾紙，將種子均勻鋪在濾紙上，并在種子上覆蓋2層濾紙待其發芽，每天噴淋相應溶液5次以保持水分，每12 h檢測1次發芽種子數。黃豆發芽以種子破皮露白超過1 mm為標準，發芽率按公式(2)計算：

(2)

1.3.5 黃豆芽的生長指標

豆芽成熟后，從每個發芽筐中隨機抽取50株黃豆芽，用直尺(最小刻度為0.5 mm)測量芽長，用游標卡尺(最小刻度為0.02 mm)測量莖粗。取平均值作為黃豆芽芽長和莖粗。

每組隨機取出100株豆芽稱重，測量黃豆芽鮮重/百株重(g/100株)。

1.3.6 黃豆芽的營養特性

黃豆芽收獲后4 h內，隨機取樣，用VC試劑盒和植物類黃酮試劑盒檢測VC和類黃酮的含量，VC含量以μg/g表示，類黃酮含量以mg/g表示。

1.3.7 數據處理

本研究的數據來源于3次獨立的重復試驗。以平均值±標準差(SD)表示。采用SPSS統計軟件(IBM SPSS Statistics 25)進行統計分析，使用SNK法分析差異顯著性，顯著性水平設置為0.05；采用Origin 2017繪圖軟件進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 SAEW對黃豆發芽過程中微生物的控制效果

SAEW處理的黃豆在發芽過程中的菌落總數、大腸菌群、霉菌和酵母總數變化如圖1所示。第4天收獲時，CK處理組黃豆芽的菌落總數達到8.59 lg CFU/g。研究表明，細菌可以在種子的縫隙中隱藏而免受消毒劑的傷害[16]。即使經消毒劑處理后殘留微生物極少，經過發芽，微生物數量也會呈指數增長，最終可達到7～8 lg CFU/g[17]。糙米經ACC為50 mg/L的SAEW浸泡30或60 min后，微生物降至無法檢出(平板菌落計數)的水平，但是在發芽48 h后，存活于糙米表皮褶皺或縫隙中的微生物快速生長繁殖，數量達到8～9 lg CFU/g[18]。如果將大腸桿菌接種在蘿卜種子上，其數量經ACC為20 000 mg/L的次氯酸鈉溶液處理后顯著減少，而發芽72 h后與未經消毒處理的對照組大腸桿菌數量處于同一水平[6]。以上研究表明，在種子的清洗、浸泡階段很難將微生物徹底殺滅，而存活下來的微生物會在發芽過程中利用合適的環境條件和種子本身的營養物質快速繁殖，數量增至較高水平。因此，在種子發芽的整個過程中都應當采取消毒措施。

本研究將SAEW應用于黃豆清洗、浸泡、發芽全過程。如圖1-a所示，第1天，經過12 h的浸泡，CK、NaCl 70、NaCl 35,、HCl 70和HCl 35處理組黃豆表面菌落總數分別為4.33、0、2.67、0、2.53 lg CFU/g，第2天分別增至7.81、5.43、6.03、5.63和6.14 lg CFU/g。菌落總數在第2天出現明顯增長，原因可能是，附著在種子上的微生物在種子發芽初期仍然處于休眠狀態，在合適條件下,一段時間后微生物被激活并迅速生長繁殖。在第4天時，CK、NaCl 70、NaCl 35、HCl 70和HCl 35處理組黃豆芽菌落總數分別為8.59、6.19、7.28、6.40和7.26 lg CFU/g，SAEW處理組顯著降低了黃豆芽表面菌落總數(P< 0.05)。與ACC為35 mg/L的SAEW相比，ACC為70 mg/L的SAEW具有更好的殺菌效果。不同電解液產生的相同ACC的SAEW對微生物的控制效果沒有顯著差異，說明ACC是SAEW殺菌的主要影響因素，電解質對其殺菌效果沒有明顯影響。各處理組大腸菌群、霉菌和酵母數與菌落總數的變化趨勢相似。

a-菌落總數;b-大腸菌群;c-霉菌和酵母圖1 黃豆發芽過程中不同處理組的微生物數Fig.1 The counts of natural microbiota on soybean sprouts treated by different solutions during seed germination注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 SAEW對黃豆發芽特性的影響

2.2.1 SAEW對黃豆吸水率的影響

如圖2-a可知，各處理組間黃豆的吸水率無顯著差異。在萌芽階段，種子需要吸收充足的水分而膨大，進而種皮破裂、出現萌芽，因此，充分吸水是種子萌發的必要條件[19]。研究表明，糙米在SAEW中浸泡24 h后，與自來水處理相比，吸水率沒有顯著差異[18]，與本研究結果相似。與自來水相比，SAEW處理對黃豆種子萌發時的吸水過程沒有不利影響。

2.2.2 SAEW對黃豆發芽率的影響

由圖2-b可知，SAEW處理組12 h時的黃豆發芽率與自來水處理組無明顯差異，但24 h的發芽率顯著高于自來水組，在發芽結束時，不同處理組的黃豆發芽率接近。有研究表明，SAEW處理對蕎麥和蘿卜的發芽率沒有顯著影響[13, 20]，與本實驗結果一致。周艷鑫等[21]用掃描電鏡觀察SAEW浸泡過的綠豆表面，發現SAEW可加重對綠豆表面的蠟狀表皮結構的破壞。水被電解以后，水分子團簇結構變小，更容易進入細胞。因此經SAEW處理，黃豆種子表皮受到破壞，相比自來水處理組更容易破裂，從而有利于萌芽較早出現，但最終發芽率與自來水處理組趨于一致。

a-吸水率;b-發芽率圖2 不同處理組黃豆的發芽特性Fig.2 The geimination properties soybean sprouts treated by different solutions

2.3 SAEW對黃豆芽生長指標的影響

黃豆發芽4 d后收獲并測定其芽長、莖粗、鮮重，結果如表2所示。SAEW處理組黃豆芽的芽長較自來水處理組芽長短，ACC較大的SAEW對芽長的抑制更明顯；然而，經SAEW處理的黃豆芽莖粗均大于自來水處理組；各處理組間黃豆芽鮮重沒有顯著差異。自來水處理的豆芽長而細，SAEW處理的豆芽短而粗。有研究表明，相比自來水處理組，經SAEW處理后蕎麥芽的芽長較短，且高ACC(90 mg/L)的SAEW相比低ACC(10、30 mg/L)的SAEW有更顯著的抑制作用[13]，與本研究結果相似。SAEW處理雖然對黃豆芽的長度有抑制作用，但對其鮮重沒有不利影響，因此，SAEW可以用于黃豆發芽。

表2 不同處理組黃豆芽的生長指標Table 2 The growth properties of soybean sprouts treated by different solutions

2.4 SAEW對黃豆芽營養物質含量的影響

2.4.1 SAEW對黃豆芽VC含量的影響

如圖3所示，CK、NaCl 70、NaCl 35、HCl 70和HCl 35處理組的黃豆芽VC質量分數分別為6.02、5.74、6.37、6.90和7.78 μg/g。以NaCl為電解質的SAEW對黃豆芽VC含量沒有顯著影響；HCl 35處理組黃豆芽中VC含量顯著提高(P<0.05)。VC又稱為抗壞血酸，是一種重要的水溶性抗氧化劑，有利于人體健康，并在植物生長中起著重要調節作用[22]。劉瑞等[23]發現，SAEW處理可以增加綠豆芽中的VC含量；趙德錕等[24]用SAEW處理鮮切云南紅梨，雖然在貯藏期間樣品VC含量降低，但從貯藏第3天開始，SAEW處理可以顯著延緩VC的衰減，所以SAEW造成的微酸性環境可能有利于提高或保持果蔬中VC含量。研究表明，NaCl溶液處理降低黃豆芽、西蘭花芽、鹽芥的VC含量[25-27]，在本研究中，以NaCl為電解質的SAEW中含有一定量的Na+，因此經其處理的黃豆芽VC含量小于以HCl為電解質的SAEW處理組。含Na+的SAEW處理如何影響成熟黃豆芽中的VC含量有待進一步研究。

2.4.2 SAEW對黃豆芽類黃酮含量的影響

類黃酮是蔬菜中常見的酚類化合物，具有較高的抗氧化活性[28]。如圖3所示，CK、NaCl 70、NaCl 35、HCl 70、HCl 35處理組黃豆芽的類黃酮含量分別為1.58、1.48、1.42、1.78、1.85 mg/g，以NaCl為電解質的SAEW處理對類黃酮含量沒有顯著影響，HCl 35處理組黃豆芽的類黃酮含量顯著提高(P<0.05)。有研究表明，SAEW能夠提高綠豆萌發過程中多種抗氧化酶活性[29]；賈國梁[30]研究發現，在山藥的儲存過程中，SAEW處理組樣品的抗氧化能力較強，且保持了較高的類黃酮含量。由此可見，SAEW可能提高了黃豆芽的抗氧化能力，通過提高類黃酮合成酶(如苯丙氨酸解氨酶、查爾酮異構酶等)活性促進黃豆芽中類黃酮的積累。本研究中，在其他條件都相同的情況下，電解質為HCl的SAEW處理組黃豆芽的類黃酮含量均高于電解質為NaCl的SAEW處理組。研究表明，NaCl溶液處理降低了黃豆芽中多酚、黃酮的含量[25]。經過SAEW浸泡處理，綠豆表皮結構的破壞加重[21]；次氯酸鈉處理削弱了兜蘭種子細胞壁的完整性[31]；LIANG等[13]的研究表明，經過SAEW處理，相比自來水，蕎麥吸收了更多的SAEW。經電解后，水分子團簇結構變小，水分子協同各種離子更容易進入植物細胞。因此，以NaCl溶液為電解質的SAEW可能破壞了黃豆芽表面組織結構，使大量Na+進入豆芽。黃豆是鹽敏感型作物[32]，Na+主要在大豆根中積累[33]，大量Na+造成的離子毒性使細胞膜透性增加，豆芽生理紊亂、滲透失衡，耐受性降低，影響正常發芽過程，使類黃酮的合成受阻[34]。SAEW處理對黃豆芽類黃酮含量的影響機制還需要進一步研究。

圖3 不同處理組黃豆芽的營養特性Fig.3 The nutritional properties of soybean sprouts treated by different solutions

3 結論

不同電解質(NaCl和HCl溶液)、不同ACC(35和70 mg/L)的SAEW應用于黃豆發芽過程，能夠有效降低菌落總數、大腸菌群、霉菌和酵母數，對黃豆的發芽和黃豆芽產量沒有不利影響。并且以HCl為電解質的SAEW可提高黃豆芽的VC和類黃酮含量。不同電解質(NaCl和HCl溶液)對SAEW的殺菌效果、對黃豆芽的發芽特性和生物特性沒有明顯影響。同樣以HCl為電解質，相比ACC為35 mg/L的SAEW，ACC為70 mg/L的SAEW對微生物的控制效果更好，但經較高ACC的SAEW處理的黃豆芽芽長較短、VC和類黃酮含量均略低。因此，從微生物安全性、芽苗菜食用性及營養等方面考慮，電解HCl溶液產生的ACC為35 mg/L的SAEW更適合黃豆芽的生產。