富含大豆異黃酮的凝固型發酵豆芽乳配方優化

羅揚,陳瑋瑋,鄭茜,2,高猛峰,3,高梅安琪,易恩,譚海青,商攀飛,梁小波*

1(昆明理工大學 農業與食品學院,云南 昆明,650500)2(西南大學 生物技術學院,重慶,400715)3(華東理工大學 生物工程學院,上海,200237)

大豆富含多種營養物質，其中蛋白質含量高達40%，是理想的蛋白質食品。大豆發芽后，蛋白質被豆內生物酶分解，氨基酸得以積累，部分油脂被分解，這些變化使營養物質更易被人體消化吸收[1-2]。據報道，發芽能改變大豆中某些化學成分(蛋白質、抗營養因子等)的組成，消除腸胃脹氣的同時促進腸道吸收[3-5]，豐富 γ-氨基丁酸、異黃酮、VC等功能成分[6-7]。

乳酸菌是公認的益生菌，具有改善腸道微生態、利于消化吸收、抑制有害微生物等生理功能[8]。研究發現植物乳桿菌(來源于泡菜)用于發酵豆乳具有良好的生長及穩定特性[9]；羅伊氏乳桿菌易定植腸道調節后者免疫系統[10]，其發酵液具有抑菌效果，且未見到用于發酵豆芽乳的報道。乳酸菌能有效地將大豆異黃酮(soybean isoflavone，ISO)轉化為更容易被腸道吸收的大豆異黃酮苷元。后者是常用的營養保健品，能有效預防心血管疾病、惡性腫瘤和骨質疏松癥[11]。此外，豆乳制品不含膽固醇和乳糖，其發酵產品可作為動物乳制品的替代物，緩解乳糖不耐癥[12]。研究乳酸菌發酵豆芽乳飲料，充分利用我國大豆資源，發揮乳酸菌發酵特有的作用，解決豆芽貨架期短的問題[13]，獲得接受度好的豆芽乳產品，具有良好的市場開發前景。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆，市售；藕粉，云南德春綠色食品有限公司；食品級檸檬酸，吳江市恒達精細化工有限公司；大豆異黃酮標準品，上海伊卡生物技術有限公司；食用白砂糖、食用NaHCO3和食用葡萄糖,均從當地市場購買。

1.2 菌種

植物乳桿菌(CICC 20265)、羅伊氏乳桿菌(FS002)，來自實驗室分離；嗜熱鏈球菌(CICC 20174)、保加利亞乳桿菌(CICC 20358)，市售。低溫保藏的菌種用MRS瓊脂培養基復壯3代，獲得生長旺盛的發酵菌種。

1.3 儀器與設備

CB-A360B型豆芽機，佛山市順德區嘉壕實業有限公司；JM-130型膠體磨，廊坊市冠通機械有限公司；GJJ-0.03/60型高壓均質機，上海臺馳輕工裝備有限公司；TSX-5005PD 型4 ℃冰箱、XR1型臺式高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；DW-HL538型-80 ℃超低溫冰箱，中科美菱低溫科技有限責任公司；BPH9082型恒溫生化培養箱，海博訊實業有限公司醫療設備廠；1260 infinity型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；VCX130型超聲波破碎儀：美國Sonics。

1.4 工藝及優化方法

1.4.1 工藝流程

凝固型發酵豆芽乳制作工藝流程如下：

大豆芽→磨漿→過濾→去腥味→調配→均質→殺菌→冷卻→接種→發酵→后熟→成品

大豆發芽48 h，NaHCO3去除澀味。均質[14]：混合液均質時間3～5 min，壓力25～30 MPa。巴氏殺菌并冷卻至40 ℃，接菌。

1.4.2 發酵菌種的篩選

以植物乳桿菌∶羅伊氏乳桿菌為2∶2、1∶2、2∶1、1∶1進行實驗[15-16]，乳酸發酵劑(嗜熱鏈球菌∶保加利亞乳桿菌=1∶1)為1%[17]，分別記為A、B、C、D組，E為只含1%發酵劑的對照組。測定發酵完成時樣品的pH值，菌落總數和時間，結合感官評價，確定乳酸菌菌種配方。

1.4.3 發酵條件優化

(1)糖的添加量

固定蔗糖添加量為原料液質量的5%[15]，葡萄糖的添加量(質量分數)分別為0%、1%、2%、3%、4%進行發酵，記錄樣品的pH，結合感官評價得出添加糖的比例。

(2)豆芽與水的比例

為了獲得組織均勻、黏稠的凝固型發酵乳，豆芽與蒸餾水分別以1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8 (g∶mL)送入膠體磨(記為A、B、C、D、E、F組分)，120目濾布過濾后稱量濾渣質量，測定發酵乳黏度、pH和感官評價。

(3)穩定劑的添加

為了解決發酵豆芽乳穩定性問題，首次嘗試以藕粉作為單一穩定劑。并以添加量(質量分數)為0%，1%，2%，3%，加入到豆乳中發酵，結合pH，持水力和感官評價結果得出藕粉的添加量。

(4)發酵溫度的確定

為了確定乳酸菌的最適發酵溫度，以溫度為唯一自變量，記錄凝固時間和pH值，結合感官評價確定最佳溫度條件。樣品分別置于35、36、37、38、39、40、41 ℃的恒溫生化培養箱內發酵。

(5)最佳發酵工藝確定

分別以葡萄糖添加量，豆水比例，穩定劑添加量，發酵溫度為因素，采用L9(34)表做正交實驗(見表1)。根據凝固時間和pH，結合感官評價確定最佳發酵條件。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Table of orthogonal experimental factors

1.4.4 方法

(1)乳酸菌活菌數測定：參照文獻[18]方法測定。

(2)pH值：采用FE20型pH計進行測定。

(3)黏度：采用黏度計在室溫下對樣品黏度進行測定。先用蒸餾水標定，再用待測樣品進行測量，記錄數據。

(4)持水率：樣品置于離心管中稱重，記為樣品凈重m1，g；總質量為m2，g；以5 000 r/min離心30 min，去除上清液且倒置離心管10 min，稱重記為m3，g；計算持水率，如公式(1)，結果取正值。

(1)

(5)ISO含量：根據CHUN等[19]的方法用乙醇提取，C18-H柱(250 mm×4.6 mm)檢測大豆發芽及發酵對異黃酮含量的影響。樣品冰水浴超聲10 min，離心收集上清液，通過0.22 μm濾膜過濾后用于高效液相色譜鑒定。檢測波長為254 nm，樣品以10 μL進樣。

(6)感官評價：根據GB 19302—2010方法進行感官評價[20]。

表2 乳酸菌發酵豆芽乳感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standard for lactic acid bacteria fermented bean sprout milk

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的影響

由圖1可知，C組乳酸菌組合經4 h發酵完成，產酸量多于其他組合，活菌數為3.6×108CFU/mL，感官評分最高；A組感官評分與C組合一致，菌種添加量最多；E組耗時最長為8 h，乳酸菌活菌數最低。因此選擇C組合作為乳酸菌的配方，即植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和發酵劑分別為2%、1%、1%。

圖1 發酵菌種組合及添加量Fig.1 Different combination and addition under bacterial for fermentation 注：A-2%植，2%羅，1%發酵劑；B-1%植，2%羅，1%發酵劑；C-2%植，1%羅，1%發酵劑；D-1%植，1%羅，1%發酵劑；E-1%發酵劑

2.2 豆芽乳發酵條件的確定

2.2.1 葡萄糖的影響

由圖2可知，發酵乳的酸度隨葡萄糖量增加而增加，無添加葡萄糖的發酵乳發酵不足，口感一般；葡萄糖添加量(質量分數)達3%時，發酵乳感官評分為92分；葡萄糖添加量4%的發酵乳產酸量最多，感官評分降低。因此，葡萄糖添加量應為3%。

圖2 葡萄糖添加量對發酵豆芽乳的影響Fig.2 Effect of glucose addition on fermented bean sprouts milk

2.2.2 豆水比的影響

由圖3可知，發酵乳的黏稠度隨含水量增加而降低。實驗組D中原料的含水量為80%，其酸度稍高，黏稠度較高；E組含水量為83.3%，黏度迅速降低，乳質地均勻不分層，細膩爽口；F組含水量高達85.7%，豆芽濾渣最少，黏度值最低，乳中有少量乳清析出，酸甜合適，口感細膩柔和，因此豆水比1∶6為佳。

圖3 原料含水量對發酵豆芽乳的影響Fig.3 Effect of water addition of raw materials on fermented bean sprouts milk注：A-豆水比1∶3；B-豆水比1∶4；C-豆水比1∶5；D-豆水比1∶6；E-豆水比1∶7；F-豆水比1∶8

2.2.3 穩定劑的影響

蓮藕在我國種植范圍廣泛[21]，由蓮藕加工而成的藕粉是食品加工業的重要原輔料[22]。藕粉與其他淀粉配合成穩定劑使用已有報道[23]，但單獨使用較少見。本研究以藕粉作為穩定劑，結果由圖4可知，藕粉添加量(質量分數)為2%時，發酵乳持水率最高，產酸最多，感官評分最高，故選擇添加量為2%的藕粉作為穩定劑。這表明，藕粉可以單獨作為食品穩定劑添加，且發酵乳的組織及風味都達到標準。

圖4 穩定劑添加量對發酵乳的影響Fig.4 Effect of stabilizer addition on fermented soymilk

2.2.4 發酵溫度的影響

由圖5可知，當發酵溫度為37 ℃時，豆芽乳的凝固時間最短為4 h，可節約生產成本；在37 ℃時，豆芽乳產酸最多，感官評分最高，因此選擇37 ℃為發酵溫度。

圖5 溫度對豆芽發酵乳的影響Fig.5 Temperature effect on fermented soymilk

2.2.5 豆芽乳的最佳發酵條件

由表3可知，A2，B1，C2，D3條件綜合得分最高，發酵乳色澤、組織形態、風味等的綜合評定結果最好。由極差分析R值A>C>B>D可知，對發酵豆芽乳的影響為葡萄糖>穩定劑(藕粉)>豆水比例>溫度；所以凝固型豆芽發酵乳的最佳工藝配方為葡萄糖添加量3%，穩定劑藕粉添加量2%，原料豆水比為1∶5，39 ℃發酵。以該條件進行發酵驗證，所得發酵乳pH 4.2，活菌數為3.6×108CFU/mL，發酵乳品質達到標準。

表3 正交試驗結果Table 3 Orthogonal test results

2.3 大豆異黃酮的分析

通過乙醇提取，高效液相色譜定量分析，經發芽及發酵處理ISO含量變化如表4所示。

表4 發芽與發酵處理對異黃酮的含量影響 單位：mg/mL

發芽與發酵一定程度的促進了大豆異黃酮含量的變化。發芽處理顯著增加了大豆苷(34.1%)、大豆苷元(30.2%)和染料木素(59.4%)的含量；發酵處理的大豆苷和大豆苷元含量變化顯著(P<0.05)，黃豆黃素苷元和染料木素含量增加，但與未發酵乳差異不顯著；該過程染料木苷與黃豆黃素苷元的變化均不顯著，進一步表明異黃酮有一定的穩定性。此外，染料木素具有抗腫瘤、抗氧化及抑菌作用[24]，與大豆苷和黃豆黃素苷元在發酵乳中含量較高，表明乳酸菌發酵可能促進了ISO向活性更高的苷元轉化[25]，利于腸道對ISO的高效吸收。

3 結論

以發芽大豆為原料，得出配方(均為質量分數)植物乳桿菌(2%)、羅伊氏乳桿菌(1%)與發酵劑(1%)混合使用增加益生菌活性，延長發酵乳貨架期；優化的葡萄糖量為3%，原料乳含水量83.3%，發酵溫度為39 ℃，藕粉添加量2%，藕粉單獨作為穩定劑能提高發酵乳的穩定性；檸檬酸為0.02%，檸檬酸可改善發酵乳口感。本研究發現，發芽處理促進功能因子大豆異黃酮積累，乳酸菌發酵使其發生一定程度的水解，補償了發酵乳中的大豆異黃酮苷元。綜上所述，通過優化豆芽發酵乳工藝條件，獲得了高活性的大豆異黃酮，豐富了發酵乳的功能因子，因此，本文最佳工藝發酵的豆芽乳可作為良好的功能性發酵乳制品。