外源添加物對桑椹果酒揮發酸及風味的影響

左勇，陳靜，張晶，許努謙

1(四川師范大學 生命科學學院， 四川 成都， 610101)2(宜賓學院 質量管理與檢驗檢測學部， 四川 宜賓， 644000)3(重慶大學 生物工程學院， 重慶， 400044)4(成都裕智果業有限公司，四川 成都， 610307)

桑椹果酒是以成熟桑椹鮮果為原料，經酵母發酵釀造而成，具有極高的營養價值和保健功效[1-3]。目前，對桑椹果酒的研究主要集中在菌種的選育、工藝的優化、營養和風味成分分析等方面，這有助于提升桑椹果酒的營養價值，利于消費者的身體健康[4-10]。然而，在桑椹果酒發酵過程中，普遍存在揮發酸較高的問題。揮發酸是桑椹果酒發酵過程中產生的副產物，其主要成分是乙酸，此外還有少量的甲酸、丙酸、丁酸等脂肪酸[11]。揮發酸是一類損害性物質，會帶來尖酸感和不愉快的醋味，其含量過高會損害果酒的風味和口感。因此，控制桑椹果酒揮發酸含量對提升桑椹果酒品質具有重要意義。

目前，果酒揮發酸的研究主要集中在果酒專用酵母的選育、醋酸代謝途徑的分析及發酵條件的優化[12-13]。VILELA等[14]從不同分離源中分離得到135株酵母，4株酵母能同時利用葡萄糖和醋酸，其中2株菌具有良好的發酵性能，將其進一步應用于不同濃度醋酸和乙醇環境中進行發酵，結果顯示,2株菌均能較好降解醋酸[15]。VASSEROT等[16]對釀酒酵母醋酸代謝效果的研究發現，酵母對醋酸的代謝量隨初始醋酸濃度的增加而增加，但當醋酸質量濃度超過1 g/L時，達不到降酸效果。因此，本研究通過優化發酵條件，即向桑椹發酵醪添加酶和金屬離子，研究其對揮發酸的影響，并分析不同發酵條件桑椹果酒的品質，以期在控制揮發酸的同時，提升果酒品質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑椹,產自四川，酸度為3.3～3.5 g/L，糖度約為10 °Bx；活性干酵母,購于安琪酵母股份有限公司。

LB20T型手持糖度計，成都格納絲商貿有限公司；STARTER，2C型pH計，奧豪斯儀器(上海)有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市正基儀器有限公司；BT125D型分析天平，上海精密科學儀器有限公司；T6型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；GZ-250-HS11型恒溫恒濕箱，韶關市廣智科技設備有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；日立L-8800型全自動氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

桑椹果酒的制作工藝流程如下：

桑椹果實→破碎打漿→成分調整(添加白砂糖、調酸)→主發酵→分離→后發酵→初濾→調整→陳釀→澄清→精濾→裝瓶→殺菌[17]

操作要點[18]：將桑椹破碎打漿得桑椹汁，添加白砂糖、檸檬酸以調整果醪糖度和酸度; 按比例接入酵母種子液于桑椹果醪中，將發酵醪置于一定溫度下發酵7 d，發酵過程中進行攪拌以便完全發酵;發酵結束時進行倒罐，并根據果醪糖度和酒精度，補加白砂糖，封罐進入后發酵，發酵8～10 d至殘糖質量濃度<4 g /L;經后發酵的桑椹果酒密封陳釀3～6個月; 陳釀結束后，桑椹果酒經板框過濾機過濾、裝瓶并進行巴氏滅菌。

1.2.2 桑椹果醪成分調整及接種發酵

桑椹果酒常規發酵條件為調節發酵醪糖質量濃度為150 g/L，并按1 g/L的量加入檸檬酸以調節發酵醪酸度，酵母接種量為2 g/L，發酵醪于26 ℃發酵7 d。

1.2.3 酶對桑椹果酒揮發酸的影響[19]

1.2.3.1 酶添加時間對桑椹果酒揮發酸的影響

在桑椹果酒發酵前4 d，每天以0.2%(體積分數)的添加量向發酵醪分別加入單一酶制劑(果膠酶、纖維素酶和糖化酶)，同時以不添加酶的試驗組作為對照。發酵結束時分析桑椹果酒中揮發酸和酒精含量。

1.2.3.2 酶添加量對桑椹果酒揮發酸的影響

向發酵醪分別添加不同體積分數(0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%)的單一酶制劑(果膠酶、纖維素酶和糖化酶)，同時以不添加酶的試驗組作為對照,發酵結束時分析桑椹果酒揮發酸和酒精含量。

1.2.3.3 復合酶對桑椹果酒揮發酸的影響

根據各種酶的最適添加量，分別向發酵醪加入單一酶和復合酶制劑(分別為：果膠酶、纖維素酶、糖化酶、果膠酶+纖維素酶、果膠酶+糖化酶、纖維素+糖化酶、果膠酶+纖維素酶+糖化酶)，同時以不添加酶的試驗組作為對照,發酵結束時分析桑椹果酒揮發酸含量。

1.2.4 金屬離子對桑椹果酒揮發酸的影響[20]

分別向桑椹發酵醪添加不同濃度(1、2、3、4、5 mmol/L)Zn2+、K+、Mg2+和Ca2+，以不添加金屬離子的試驗組作為對照，發酵結束時分析桑椹果酒揮發酸和酒精含量。

1.2.5 不同外源添加物對桑椹果酒品質的影響

在前期研究基礎上，分別向發酵醪添加復合酶(0.05%果膠酶、0.1%纖維素酶、0.05%糖化酶)和Mg2+，同時以不添加外源物質的常規發酵試驗組作為對照。發酵結束時對桑椹果酒的主要理化指標、氨基酸、揮發性風味成分進行分析、評價。

1.2.6 主要理化指標分析

揮發酸、總酸、總糖參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定[21]；酒精度采用分光光度法[22]；揮發性風味成分參照張晶等[23]桑椹果酒揮發性風味成分的檢測方法。

1.2.7 游離氨基酸

游離氨基酸樣品前處理參照李俊芳等[24]的處理方法。取適量桑椹果酒置于密封袋超聲20 min，精確稱取1 g樣品，加入4%(體積分數)磺基水楊酸25 mL、過夜、10 000 r/min離心15 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，上機待測。

游離氨基酸由全自動氨基酸分析儀檢測，其條件為：流速0.40 mL/min(pump1)，0.35 mL/min(pump2)；檢測波長570、 440 nm；柱溫135 ℃(反應柱)、57 ℃(分離柱)；進樣體積20 μL；游離氨基酸含量由儀器自帶程序計算。

2 結果與分析

2.1 酶添加時間對桑椹果酒揮發酸的影響

由于發酵醪中多糖類大分子物質的存在，酵母不能直接利用，正常的酒精發酵受阻，易產生揮發酸等副產物，從而損害果酒的品質[25]。為降解桑椹發酵醪中多糖類物質，從桑椹果酒發酵0～4 d，分別向發酵醪液中加入果膠酶、纖維素酶和糖化酶，探究其對桑椹果酒揮發酸的影響，結果如圖1所示。

圖1 酶添加時間對桑椹果酒揮發酸的影響Fig.1 Effect of addition time of enzyme on volatile acidity of mulberry wine

由圖1可知，桑椹果酒發酵前2 d加入酶制劑，揮發酸含量均有不同程度的降低，表明加入酶制劑對揮發酸有較好的控制效果。且果膠酶和纖維素酶加入時間越早，揮發酸含量越低，其最佳添加時間為發酵第0天，揮發酸含量分別降低12.8%、10.1%。而糖化酶的最佳添加時間為發酵第2天，揮發酸含量降低6.0%。

2.2 酶添加量對桑椹果酒揮發酸的影響

水果中普遍含有豐富的果膠、纖維素、淀粉等多糖類物質。多糖類大分子物質易造成果醪渾濁、不均一，影響正常的酒精發酵，導致揮發酸、高級醇等副產物的產生，進而損害果酒的品質。果酒生產中，通常會用果膠酶、纖維素酶和糖化酶進行酶解處理[26]，其中果膠酶、纖維素酶可以快速徹底地降解果膠、纖維素等物質，降低果汁黏度，改善果汁成分，使果汁澄清透亮[27]；糖化酶能將淀粉類物質降解為葡萄糖等易于被酵母利用的小分子物質。本次試驗分別研究了單一酶和復合酶對果酒揮發酸的影響。

2.2.1 單一酶對桑椹果酒揮發酸和酒精含量的影響

果膠酶、纖維素酶及糖化酶對桑椹果酒揮發酸和酒精含量的研究結果如圖2所示。

由圖2-a可知，隨著果膠酶的增加，桑椹果酒中揮發酸含量大致呈先降低后升高的變化趨勢，酒精含量先升高后降低。當添加果膠酶體積分數為0.05%時，揮發酸含量最低，為0.57 g/L，比不添加果膠酶時降低了13.7%。通過向桑椹發酵醪中加入果膠酶，桑椹果膠物質被降解，這一方面改善了果醪中的物質分布，另一方面降低了發酵醪的黏稠度，增加果醪的流動性，有利于酵母發揮正常的發酵性能，從而促進酒精發酵，控制了揮發酸的形成[28]。

隨著纖維素酶的增加，桑椹果酒中揮發酸含量先降低后升高，酒精含量大體呈逐漸上升的趨勢(圖2-b)。當添加纖維素酶體積分數為0.1%時，揮發酸含量最低，且酒精含量達到最高。這可能是由于纖維素酶的加入，細胞壁破裂，纖維素被降解為葡萄糖等小分子物質，細胞內物質也隨之浸出，這不僅增加了發酵底物，也降低了果醪黏度，使整個發酵體系更適于酵母的繁殖、代謝，有利于反應向酒精生成的方向進行，同時也有效控制了揮發酸的生成[29]。

由圖2-c可知，隨著糖化酶的增加，桑椹果酒中揮發酸含量呈先降低后上升的變化趨勢，酒精含量先升高后降低。當添加糖化酶體積分數為0.05%時，揮發酸含量最低，為0.60 g/L，比不添加糖化酶時降低了10.3%。這可能是由于糖化酶可以將多糖轉化為可被酵母直接利用的葡萄糖[30]，有利于正常的酒精發酵，同時降低了揮發酸等副產物的生成。

2.2.2 復合酶對桑椹果酒揮發酸的影響

由圖3可知，在桑椹果酒發酵過程中，同時添加3種酶對揮發酸的控制效果最好，優于2種酶和單一酶，其揮發酸含量比不添加酶的試驗組降低15.3%。

a-添加果膠酶；b-添加纖維末酶；c-添加糖化酶圖2 酶添加量對桑椹果酒揮發酸的影響Fig.2 Effect of addition content of enzyme on volatile acidity of mulberry wine

在桑椹中，果膠和纖維素構成相鄰細胞中間層黏結物，使組織細胞緊緊黏結在一起[31]。由果膠酶、纖維素酶和糖化酶組成的復合酶會對桑椹果實細胞壁產生更大的破壞作用，對細胞壁的降解作用更好，使果膠和纖維素等物質被降解為葡萄糖等小分子化合物，而細胞內的多糖類物質也隨著細胞的破裂浸出，被糖化酶進一步降解，這都有利于酵母對發酵底物的利用，同時由于復合酶的加入，提高了出汁率，使發酵醪澄清、均勻，更利于酒精發酵的進行。

圖3 復合酶對桑椹果酒揮發酸的影響Fig.3 Effect of component enzyme preparation on volatile acidity in mulberry fruit注：果,代表果果膠酶；纖,代表纖維末酶；糖,代表糖化酶

2.3 金屬離子對桑椹果酒揮發酸的影響

微生物正常的生長、繁殖和代謝需要外界提供充足的營養物質，其中無機鹽(金屬離子)是重要的營養要素。金屬離子在微生物體內的作用廣泛，如構成細胞內一般分子成分；作為酶的組成成分及其激活劑或抑制劑；調節發酵環境的滲透壓、pH值、氧化還原電位等。本次試驗研究了金屬離子對桑椹果酒揮發酸的影響。

2.3.1 金屬離子對桑椹果酒揮發酸的影響

由圖4可知，向桑椹發酵醪中添加Zn2+、K+、Mg2+均有利于揮發酸的控制。隨著金屬離子濃度的增加，揮發酸含量呈先降低后升高的變化趨勢。當Zn2+、K+、Mg2+濃度分別為2、 2、 4 mmol/L時，揮發酸質量濃度最低，分別為0.68、0.69、0.65 g/L。這可能是由于Zn2+參與構成乙醇脫氫酶的活性中心，對酶蛋白結構的穩定起到重要的作用，適量的Zn2+有利于乙醇脫氫酶發揮活性，使酒精發酵更好的進行，同時也減少揮發酸等副產物的生成[32]；K+對維持細胞內外滲透壓起著重要的作用[33]；Mg2+是微生物體內多種酶的激活劑，適量濃度的Mg2+能激活糖酵解途徑相關酶活性，促進酵母代謝的正常進行，而過量的Mg2+會抑制酵母的生長，出現發酵遲緩，不利于酒精發酵[34]。當加入Ca2+時，桑椹果酒揮發酸含量隨著Ca2+濃度的增加逐漸升高。可能是由于Ca2+的加入，改變了揮發酸代謝途徑中相關酶的活性，乙醛脫氫酶活性提高，使醋酸合成量增加，另一方面乙酰輔酶A合成酶活性降低，使乙酸代謝途徑反應受阻，從而引起揮發酸的升高[35]。

圖4 金屬離子對桑椹果酒揮發酸的影響Fig.4 Effect of metal ions on volatile acidity of mulberry fruit

2.3.2 金屬離子對桑椹果酒酒精含量的影響

由圖5可知，向桑椹發酵醪中添加Zn2+、K+、Mg2+均有利于酒精的生成。當Zn2+、K+濃度為2 mmol/L時，酒精度達到最高，為7.5%vol。Mg2+的最適濃度為4 mmol/L，其酒精度為7.4%vol。當加入Ca2+時，桑椹果酒酒精含量隨著Ca2+濃度的增加逐漸減低。這可能是由于金屬離子的加入，調節了桑椹果醪的發酵環境，使反應向有利于酒精生成的方向進行，同時減少發酵副產物的生成。

圖5 金屬離子對桑椹果酒酒精含量的影響Fig.5 Effect of metal ions on alcohol of mulberry fruit

2.4 不同外源添加物對桑椹果酒品質的影響

2.4.1 主要理化指標

桑椹果酒主要理化指標如表1所示。

表1 桑椹果酒主要理化指標Table 1 Main physical and chemical indexes of mulberry wine

由表1可知，以上3種桑椹果酒揮發酸均低于行業標準規定的1.5 g/L，總酸為4～9 g/L，酒精度為7%vol～18%vol，殘糖含量低于干型桑椹果酒規定的4 g/L，表明3種條件下釀造的桑椹果酒均能達到行業標準要求，其中，添加復合酶的桑椹果酒揮發酸含量最低，酒精度最高。

2.4.2 游離氨基酸

游離氨基酸可呈現酸、甜、苦、澀、鮮等味道，賦予果酒豐富的味覺層次，其組成和含量能夠部分反映桑椹果酒的營養價值。由表2可知，從桑椹果酒中共檢測出17種氨基酸，甜味氨基酸有蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸和脯氨酸；鮮味氨基酸有谷氨酸；酸味氨基酸有天冬氨酸；苦味氨基酸有半胱氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸和酪氨酸；澀味氨基酸有纈氨酸和亮氨酸。3種果酒氨基酸呈味均以甜味為主，鮮味和苦味次之，澀味再次之，酸味最弱。果酒中谷氨酸、絡氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸含量均較高，其中，甘氨酸不僅能提供清甜味，還能減少苦味。不同果酒中，各種氨基酸含量以及氨基酸總量均呈現較大差異。總體上看，添加復合酶的桑椹果酒游離氨基酸總量高于其他2種桑椹果酒。

表2 桑椹果酒游離氨基酸 單位：mg/L

2.4.3 揮發性風味成分

桑椹果酒揮發性風味成分離子流圖譜如圖6所示，其相對百分含量如表3所示。

圖6 桑椹果酒揮發性成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.6 GC-MS total ion chromatogram of volatile flavor components of mulberry wine

表3 桑椹果酒揮發性風味成分 單位：%

揮發性風味成分的種類和含量會影響桑椹果酒的品質，是評價桑椹果酒內在品質的一項重要指標。由表3可知，從常規發酵條件、添加復合酶和添加Mg2+的桑椹果酒中分別檢測到28、33、23種揮發性風味成分，其中醇類和酯類占總量的90%以上，是桑椹果酒中最主要的揮發性風味成分。添加復合酶的桑椹果酒揮發性風味成分最豐富，其醇類和酯類的種類也高于其他2種條件下發酵的果酒，這可能是由于復合酶的添加促進了桑椹大分子物質的降解，發酵醪中物質間相互作用，形成良好的發酵環境，更有利于風味物質的形成。

3 結論

酶制劑和金屬離子均有助于桑椹果酒揮發酸的控制，果膠酶和纖維素酶的最佳添加時間為發酵第0天，最適添加量分別為0.05%、0.1%(體積分數)；糖化酶的最佳添加時間為發酵第2天，最適添加量為0.05%(體積分數)；Zn2+、Mg2+、K+的最適添加量分別為2、4、2 mmol/L。添加復合酶(0.05%果膠酶、0.1%纖維素酶、0.05%糖化酶)時揮發酸含量最低，其含量比不添加酶制劑降低15.3%。在添加不同外源物質的桑椹果酒中，添加復合酶的桑椹果酒揮發酸含量最低(0.66 g/L)，游離氨基酸含量最高(532.11 mg/L)，揮發性風味成分最豐富(33種)，既有效控制了桑椹果酒揮發酸含量，又保證了桑椹果酒優良的品質。本研究為桑椹果酒揮發酸的控制提供了理論依據，不僅有利于降低桑椹果酒揮發酸，促進品質提升，同時也為其他果酒揮發酸的控制提供解決方案。