植物精油對黃瓜貯藏效果的影響

潘小軍，高陽，翁甜

(宜春學院 生命科學與資源環境學院，江西省作物生長發育調控重點實驗室，江西 宜春，336000)

采后真菌病害是引起果蔬品質劣變的主要原因之一。黃瓜作為一種組織柔嫩，含水量高的蔬菜，具有易腐性，極易引起真菌病害，在貯藏過程中易出現失水萎蔫，表皮變黃，硬度降低等品質變化[1]。其中，黃瓜炭疽病是由半知菌亞門真菌，葫蘆科刺盤孢菌侵染所致，是瓜類作物生產中的主要病害之一，在全國各地均有發生[2]。一般發病率為20%～40%時，產量損失10%～15%，棚室病株率嚴重時達100%，產量損失40%以上[3]。目前，化學農藥依然是生產上防治黃瓜炭疽病的主要方式，但化學農藥使用成本高，存在農藥殘留、污染環境、病原菌抗藥性增強等問題[4]。田菲菲等[2]曾報道了34種植物提取物對黃瓜炭疽病菌的抑制作用，報道表明大部分植物提取物對測試病菌具有一定程度的抑制作用。關麗杰等[4]也報道了補骨脂提取物對黃瓜炭疽病菌的抑制活性，報道表明0.2%異補骨脂查爾酮可溶液是一種很有市場前景的防治黃瓜炭疽病的植物源殺菌劑。

殼聚糖是天然生物甲殼素脫乙酰基的產物，是一種無毒無害可食用的天然物質，具有抗菌保鮮作用，可用于果蔬保鮮[5-6]。殼聚糖具有成膜性，將殼聚糖覆蓋于果蔬表面，可以對果蔬起到很好的保護作用[7-9]。目前，殼聚糖主要用于西葫蘆、冬棗、櫻桃番茄、草莓、甜櫻桃、黃瓜等果蔬的貯藏保鮮，并有一定成效。

植物精油是一類植物源次生代謝物質，分子質量較小且具有一定揮發性的油狀液體物質[10]。植物精油中大多都具有還原性，具有抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑[11]。在果蔬保鮮中，植物精油表現出一定的抑菌作用，可以有效減緩果蔬的腐爛速度[12-13]。植物精油具有無毒、無害、純天然等特點，植物精油對果蔬品質的保持具有顯著功效，對延長果蔬的貨架期具有顯著效果，采用熏蒸法、浸泡法、精油-氣調聯用、精油-羧甲基纖維素鈉/殼聚糖復配法等處理果蔬，對果蔬的貯藏保鮮有良好的效果，應用前景十分廣闊。

目前，黃瓜涂膜貯藏的研究很多，但關于植物精油聯合殼聚糖對黃瓜的貯藏保鮮的研究還未見報道，本研究以黃瓜為材料，研究預選的13種植物精油對黃瓜炭疽病菌的抑菌效果，篩選出具有較高抑菌活性的植物精油，并聯合殼聚糖，利用殼聚糖的成膜性和植物精油的抗氧化、抑菌性研究其對黃瓜貯藏效果的影響，為延長黃瓜的貯藏期及提高食用品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售新鮮青黃瓜。選取大小均勻、無機械損傷、無病蟲害、成熟度一致黃瓜的進行試驗。丁香、牛至、桂皮、百里香、迷迭香、甘草、八角、檸檬桉、雪松、鼠尾草、廣藿香、肉豆蔻、生姜精油均購于美國諾奧(Now Foods)公司。2,6-二氯靛酚溶液：稱50 mg的2,6-二氯靛酚鈉鹽(分析純，上海源葉生物科技有限公司)，溶于50 mL熱水中，冷卻后用蒸餾水定容至250 mL容量瓶中，過濾后置于棕色藥瓶中保存；0.2 mg/mL標準抗壞血酸溶液：精確稱取10 mg抗壞血酸(分析純，西隴科學股份有限公司)，用2%草酸定容到50 mL容量瓶中；2%草酸溶液：稱取20 g草酸(分析純，天津市大茂化學試劑廠)溶于1 000 mL蒸餾水中，試劑瓶保存備用；丙酮(分析純)，西隴科學股份有限公司；石英砂(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；CaCO3(分析純)，天津市大茂化學試劑廠。黃瓜炭疽病菌(ColletotrichumlagenariumCGMCC 3.2198，中國普通微生物菌種保藏管理中心)。

1.2 儀器與設備

YP電子天平，上海津平科學儀器有限公司；LRH-250型生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；HHS-21-6型電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業有限公司；YXQ-LS-100SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司；GR-240熱空氣消毒箱，上海博訊實業有限公司；MJP-150D霉菌培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；GY-3型指針式果實硬度計，樂清市艾德堡儀器有限公司；手持折光儀，上海力辰邦西儀器科技有限公司；UV-1800紫外分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃瓜炭疽病菌孢子懸浮液的制備

將黃瓜炭疽病菌(ColletotrichumlagenariumCGMCC 3.2198)接種到PDA平板培養基上，于25 ℃霉菌培養箱中黑暗培養5～7 d，待其表面長出大量孢子后，將其配制成濃度約為5×105CFU/mL的孢子懸浮液，待用[1]。

1.3.2 濾紙片擴散法測定抑菌圈大小

將培養基倒入無菌培養皿中，冷卻后加入0.10 mL上述懸浮液，用涂抹棒將表面涂勻，制成含菌平板。用鑷子將滅菌的直徑為6.0 mm的圓形濾紙片蘸取植物精油原液，貼于培養基表面，每個培養基放置3個濾紙片，擺放方式呈三角形。將制備好的培養基置于25 ℃培養箱中培養72 h，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，結果取平均值，每種植物精油做3組平行[14-17]。

1.3.3 劃線法測定最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)

在無菌條件下，將馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)培養基配制成0.012 5%～0.2%(體積分數)二倍梯度濃度的含植物精油培養基，同時設置對照(不含植物精油)，用馬克筆將培養基平均分為2份，用無菌接種環蘸取上述懸浮液在培養基上劃線，每個濃度重復3次，置于25 ℃培養箱中培養72 h，待對照組培養皿中菌絲體充分生長后，與對照相比，觀察各植物精油各濃度對菌的抑制效果，無菌生長的最低濃度即為最低抑菌濃度。

1.3.4 生長速率法測定植物精油對菌絲生長的抑制作用

在無菌條件下，將PDA培養基配制成0.012 5%～0.05%二倍梯度濃度的含植物精油培養基，同時設置對照(不含植物精油)。從培養5～7 d的黃瓜炭疽病菌菌落邊緣，用6 mm打孔器打下菌餅，在每個處理平板中央各放1塊菌餅，每種處理重復3次，置于25 ℃培養箱中培養4 d，十字交叉法測量菌落直徑(mm)，計算菌落直徑和抑菌率[1,18]如公式(1)、公式(2)所示：

菌落直徑=3次測量直徑的平均值-6

(1)

(2)

式中:A,對照菌落直徑；B,處理菌落直徑。

1.3.5 植物精油聯合殼聚糖對黃瓜貯藏品質的研究

將黃瓜分為4組，其中不處理組為對照(CK)。試驗重復3次。將殼聚糖配置成濃度為10 g/L的殼聚糖溶液，丁香精油、牛至精油、桂皮精油分別稀釋成濃度為0.05%(體積分數)，將配置好的10 g/L殼聚糖+0.05%丁香精油、10 g/L殼聚糖+0.05%牛至精油、1%殼聚糖+0.05%桂皮精油分別攪拌均勻，將黃瓜在溶液中浸泡2 min中后撈出，迅速風干并用保鮮膜包裝好，做好標記，置于25 ℃溫度下貯藏，每隔3 d天取樣，測定各品質指標。試驗重復3次。

1.3.6 失重率的測定

采用稱重法(每組20根)測定，失重率計算如公式(3)所示：

(3)

1.3.7 硬度的測定

采用GY-3果實硬度計測量，在黃瓜頭、中、尾3個部位各削去一小塊薄薄的果皮(厚約1 mm,面積約1 cm×1 cm)，用硬度計測定各部位的硬度(kg/cm2)，求平均值。

1.3.8 可溶性固形物的測定

采用手持折光儀[19]測定，先滴幾滴蒸餾水于折光鏡鏡面，合上蓋板，將儀器對向光線通過目鏡觀察。并用專用螺絲刀旋動補償器旋鈕，使視野為黑白兩色，同時使明暗分界線與標尺上的“0”位重合。然后吸取樣品液進行測定并讀取刻度尺讀數，注意蓋板時要防止產生氣泡。重復測定3次，求平均值。

1.3.9 VC含量的測定

采用2,6-二氯酚靛酚法[20]測定，稱取黃瓜果肉5.0 g，加入10 mL，2%草酸溶液，迅速搗成勻漿，充分提取VC，然后將提取液轉移至50 mL棕色容量瓶，用2%草酸溶液定容，提取 10 min。取10 mL濾液用已標定的2,6-二氯靛酚鈉鹽溶液滴定至淡紅色，且15 s內不褪色。實驗重復3次。

1.3.10 葉綠素含量的測定

采用紫外分光光度計法[19]測定。稱取1.0 g黃瓜樣品，加入少量石英砂和碳酸鈣粉及2～3 mL，80%丙酮溶液，研成勻漿，再加10 mL，80%丙酮溶液繼續研磨至組織變白。靜置3～5 min提取。將提取液過濾到50 mL棕色容量瓶中，沖洗研缽、研棒和殘渣數次，最后用80%丙酮溶液定容至50 mL，搖勻,用紫外分光光度計進行測定。

1.3.11 數據處理與分析

采用 Excel 2010 進行數據處理和作圖，采用SPSS 19.0中 Duncan 新復極差法進行差異顯著性分析，顯著性水平設置P<0.05。

2 結果與分析

2.1 植物精油對黃瓜炭疽病菌的抑制效果

13種植物精油對黃瓜炭疽病菌的抑制程度不同，如表1所示，生姜、甘草和雪松對黃瓜炭疽病菌無明顯抑菌作用，桂皮、牛至、丁香、八角以及百里香對黃瓜炭疽病菌有顯著地抑制效果(P<0.05)，抑菌圈最大達到了81.59 mm。肉豆蔻、檸檬桉、鼠尾草、廣藿香以及迷迭香的抑菌效果稍弱，但也顯示出了明顯的抑菌效果(P<0.05)。

2.2 植物精油對黃瓜炭疽病菌的最低抑菌濃度

將對黃瓜炭疽病菌抑菌圈直徑大于30 mm的5種植物精油按二倍稀釋法稀釋成0.012 5%～0.2%的濃度(體積分數)梯度，按1.3.2的操作步驟進行試驗，測定5種精油的最低抑菌濃度,結果如表2所示，桂皮精油對黃瓜炭疽病菌的最低抑菌濃度為0.012 5%，牛至精油對黃瓜炭疽病菌的最低抑菌濃度為0.025%，丁香精油對黃瓜炭疽病菌的最低抑菌濃度為0.05%，八角及百里香精油對黃瓜炭疽病菌的抑菌濃度均大于0.2%。

表1 植物精油對黃瓜炭疽病菌的抑菌作用Table 1 Antibacterial effect of plant essential oils on Colletotrichum lagenarium

表2 植物精油對黃瓜炭疽病菌的最低抑菌濃度Table 2 The minimum inhibitory concentration of plant essential oils on Colletotrichum lagenarium

2.3 植物精油對黃瓜炭疽病菌的最低抑菌濃度

將對黃瓜炭疽病菌最低抑菌濃度小于等于0.05%的3種精油按1.3.3的操作步驟進行試驗，測定3種精油對黃瓜炭疽病菌的抑菌率。結果如表3所示，對照組菌落直徑達到25.17 mm，不同濃度的桂皮、牛至以及丁香精油的菌落直徑顯著低于對照組(P<0.05)。3種精油體積分數為0.05%時均能完全抑制病菌生長。體積分數為0.025%桂皮及牛至精油仍能完全抑制菌絲生長，丁香精油的抑菌率為91.86%。當體積分數降至0.012 5%時，桂皮、牛至以及丁香精油的抑菌率分別為84.98%、100%、55.76%，抑菌效果顯著(P<0.05)。

2.4 植物精油聯合殼聚糖對黃瓜貯藏效果的影響

2.4.1 黃瓜貯藏期間失重率變化

黃瓜果實在采收后，仍有較高的呼吸作用和蒸騰作用，導致水分的流失。如圖1所示，在貯藏期間，黃瓜的失重率隨著貯藏時間的延長逐漸增加。與對照相比，采用植物精油聯合殼聚糖復合處理能夠降低黃瓜水分的散失，抑制黃瓜貯藏期間失重率的增加。在貯藏第12天，對照的黃瓜失重率為13.76%，顯著高于0.05%牛至精油+10 g/L殼聚糖處理組(9.52%)、0.05%桂皮精油+10 g/L殼聚糖處理組(8.28%)，0.05%丁香精油+10 g/L殼聚糖處理組(7.78%)(P<0.05)。植物精油涂膜處理抑制了貯藏期黃瓜的呼吸與蒸騰作用，有效減緩了黃瓜貯藏期水分的散失[21]。3個處理組比較發現，在貯藏第12天，各處理間有顯著差異，其中丁香處理組明顯低于桂皮和牛至處理組(P<0.05)。

表3 植物精油對黃瓜炭疽病菌的抑制作用Table 3 Antibacterial effect plant essential oils on Colletotrichum lagenarium

注:同列數據后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

圖1 黃瓜貯藏期間失重率變化Fig.1 Changes in weight loss rate of cucumber during storage

2.4.2 黃瓜貯藏期間硬度變化

果實硬度是衡量果實成熟度和貯藏品質的重要標志之一[22]。通過測定果實的硬度，可以掌握果實在貯藏過程中的品質變化。如圖2所示，在貯藏期間，黃瓜的硬度隨著貯藏時間的延長逐漸減少。在貯藏第6天時，不同處理果實硬度下降明顯(P<0.05)，對照組硬度為12.10 kg/cm2，處理組中丁香處理效果最好，硬度為14.55 kg/cm2，顯著高于對照組(P<0.05)。在貯藏第12天時，對照組硬度降為8.56 kg/cm2,顯著低于各處理組(P<0.05)，其中丁香精油處理組硬度為13.21 kg/cm2，桂皮精油處理組硬度為12.51 kg/cm2，牛至精油處理組硬度為9.29 kg/cm2。

2.4.3 黃瓜貯藏期間可溶性固形物變化

可溶性固形物是溶解于果蔬中的一些旋光物質，主要是糖類，是果蔬主要營養物質指標，黃瓜果實中的可溶性固形物含量能夠直接反映黃瓜的成熟程度和品質狀況[23]。圖3結果顯示，在貯藏過程中，黃瓜中的可溶性固形物含量隨著貯藏時間的延長逐漸減少。在貯藏第3天，對照組和處理組的可溶性固形物含量下降明顯(P<0.05)，對照組可溶性固形物含量降至3.25%。另外，對照組的可溶性固形物含量有所上升，原因可能是在貯藏過程中，多糖水解使還原糖含量上升，同時也在不斷進行呼吸作用消耗糖分，兩者的綜合作用使糖類物質在貯藏初期有所升高，隨后又趨于下降。在貯藏第12天時，對照組黃瓜中的可溶性固形物含量降至2.68%，丁香精油處理組的可溶性固形物含量為3.21%，顯著高于其他各處理組的含量(P<0.05)，這說明0.05%丁香精油+10 g/L殼聚糖對延緩黃瓜中可溶性固形物下降的效果最佳。

圖3 黃瓜貯藏期間可溶性固形物變化Fig.3 Changes in soluble solids content of cucumber during storage

2.4.4 黃瓜貯藏期間VC含量變化

VC含量是果蔬中最重要的營養物質之一，是黃瓜的營養品質和貯藏效果的一項重要評價指標[24]。VC不穩定，極易被氧化，易受pH、水分活度、酶等因素的影響發生降解[25]。圖4結果顯示，在貯藏過程中，黃瓜VC含量隨著貯藏時間的延長逐漸降低，原因是VC是一種熱敏性成分，極易被氧化，成熟過程中含量會有所上升，進入完熟階段后果實中VC又會受環境條件的影響而分解損失[8]。在貯藏第12天時，對照組VC含量為1.05 mg/100g，顯著低于牛至處理組的2.01 mg/100g，桂皮精油處理組的2.21 mg/100g，丁香精油處理組的2.78 mg/100g(P<0.05)。3個處理組比較發現，在貯藏第12天，桂皮處理組和牛至處理組間無顯著差異，但丁香處理組的VC含量顯著高于桂皮處理組和牛至處理組(P<0.05)，這說明0.05%丁香精油+10 g/L殼聚糖在延緩黃瓜VC含量降低的效果最佳。

圖4 黃瓜貯藏期間VC含量變化Fig.4 Changes in VC content of cucumber during storage

2.4.5 黃瓜貯藏期間葉綠素含量變化

黃瓜貯藏過程中會出現果實退綠黃化，其表皮內葉綠素含量可以反映其在貯藏期間的品質變化，是測定黃瓜品質的一項重要指標[26]。如圖5結果顯示，在貯藏過程中，黃瓜的葉綠素含量隨貯藏時間呈下降趨勢，主要是由于發生了脫鎂反應[27]。在貯藏第3天時，對照組黃瓜葉綠素含量為24.93 mg/100g，顯著低于丁香精油處理組的29.67 mg/100g，桂皮精油處理組的27.58 mg/100g，牛至精油處理組的27.43 mg/100g(P<0.05)。在貯藏第3至第9天，丁香處理組的葉綠素含量顯著高于其他各組(P<0.05)。在貯藏第12天時，對照組黃瓜葉綠素含量僅為11.53 mg/100g，與各處理組間無明顯差異。

圖5 黃瓜貯藏期間葉綠素含量變化Fig.5 Changes in chlorophyll content of cucumber during storage

3 結論

植物精油對黃瓜炭疽病菌的抑制試驗表明，在13種植物精油中，桂皮、牛至、丁香精油對黃瓜炭疽病菌的抑菌效果最佳，體積分數為0.05%的3種精油均能較好地抑制黃瓜炭疽病菌的生長，在此基礎上，利用體積分數為0.05%的3種植物精油聯合體積分數10 g/L的殼聚糖處理黃瓜，能不同程度地影響黃瓜的貯藏品質。不同植物精油處理對黃瓜貯藏品質的影響不同，與對照組相比，用0.05%丁香精油+10 g/L殼聚糖處理的黃瓜貯藏效果最好，能有效降低黃瓜的失重率，延緩呼吸作用，減少水分的散失，對黃瓜的硬度、可溶性固形物、VC、葉綠素含量的保持也有顯著效果，具有良好的抗氧化作用和抑菌作用，能夠使黃瓜維持良好的品質。桂皮精油和牛至精油對黃瓜炭疽病菌的抑制效果均強于丁香精油，但與丁香精油處理組相比，桂皮精油與牛至精油處理對黃瓜貯藏效果較差，且有加速黃瓜腐爛的表現，可能是貯藏過程中所用的精油濃度偏高，對黃瓜本身產生一定的毒害作用，使處理對黃瓜的貯藏效果不如丁香精油。植物精油對黃瓜貯藏效果的影響有待進一步研究。