液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鋁塑復(fù)合膜中芥酸酰胺和油酸酰胺

蒙芳玲,胡長(zhǎng)鷹,黎梓城,王志偉*

1(暨南大學(xué)包裝工程研究所，廣東 珠海，519070)2(暨南大學(xué) 包裝工程學(xué)院，廣東 珠海，519070)3(暨南大學(xué) 食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632)4(廣州海關(guān)技術(shù)中心國(guó)家食品接觸材料檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510075)

通過(guò)鋁塑復(fù)合手段可提高包裝材料的阻隔性，因此鋁塑復(fù)合膜常用于貨架期較長(zhǎng)或?qū)怏w敏感性較高的食品包裝[1-3]。由于靜電作用造成的吸附以及層與層之間過(guò)大的內(nèi)摩擦，塑料薄膜在生產(chǎn)和使用過(guò)程中存在開口性差等問(wèn)題，而爽滑劑的加入可以減少該現(xiàn)象的發(fā)生[4]。芥酸酰胺(erucamide, EAD)和油酸酰胺(oleamide, OAD)是最常用的2種爽滑劑，一般復(fù)配使用[5]。EAD和OAD與聚烯烴熔體相容性良好，且冷卻后會(huì)從聚烯烴薄膜內(nèi)部遷移至膜的表面，并在薄膜表面形成一層膜以降低薄膜間的摩擦系數(shù)，提高薄膜的爽滑性[6-8]。

爽滑劑在產(chǎn)品中的添加量一般為高分子材料質(zhì)量分?jǐn)?shù)的0.08%～0.4%[9]。目前爽滑劑尚未進(jìn)行完善的毒理學(xué)評(píng)估，但現(xiàn)有的研究表明爽滑劑存在一定毒性。其中EAD能夠使小鼠行動(dòng)變緩，認(rèn)知能力下降。此外，EAD水解生成的芥酸容易引起皮膚損傷[10-12]；而OAD與人體的各項(xiàng)生理活動(dòng)及代謝過(guò)程密切相關(guān)，屬于內(nèi)源性并具有生物活性的一類物質(zhì)[13]。食品接觸材料中的OAD可遷移至食品，再通過(guò)膳食進(jìn)入人體[14]，而通過(guò)外源途徑進(jìn)入人體的OAD有可能對(duì)人體的各項(xiàng)生理過(guò)程和代謝產(chǎn)生干擾[15]。

目前，針對(duì)EAD和OAD的檢測(cè)方法主要包括氣相色譜法[16-18]、氣相色譜-質(zhì)譜法[11,19-20]、高效液相色譜法[21-22]、液相色譜-質(zhì)譜法[15,23]等。如朱麗嫻等[24]利用HPLC檢測(cè)經(jīng)二甲苯溶解聚乙烯提取的EAD；LYU等[11]采用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)聚乙烯包裝材料中EAD和OAD，但這些方法存在檢出限高和檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)等不足。本文在前人的研究基礎(chǔ)上，在檢測(cè)條件和樣品前處理上進(jìn)一步優(yōu)化，以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鋁塑復(fù)合膜中EAD和OAD的含量，該方法快速高效、操作簡(jiǎn)單，為鋁塑復(fù)合膜中EAD和OAD的檢測(cè)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食品級(jí)均聚聚丙烯母粒(型號(hào)：PPH-T03；熔點(diǎn)156 ℃),中國(guó)石油化工股份公司茂名分公司；市場(chǎng)銷售的11種鋁塑復(fù)合和鍍鋁復(fù)合食品包裝膜或包裝袋，由廣州海關(guān)技術(shù)中心國(guó)家食品接觸材料檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

芥酸酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，北京百靈威科技有限公司；油酸酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)，美國(guó)Sigma公司；芥酸酰胺(純度85%，用于制備陽(yáng)性鋁塑復(fù)合膜)、油酸酰胺(純度70%，用于制備陽(yáng)性鋁塑復(fù)合膜)，上海麥克林生化科技有限公司。

甲醇(色譜級(jí))、乙醇(色譜級(jí))、二氯甲烷(色譜級(jí))、正己烷(色譜級(jí))，美國(guó)Fisher chemical公司；丙酮(分析純)，廣東廣試試劑科技有限公司；環(huán)己烷(分析純)，二甲苯(分析純)，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent 1200-6460)，美國(guó)Agilent公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9240MBE)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；樣品自動(dòng)濃縮工作站(Turbo VAPII)，美國(guó)Caliper公司；EL104電子分析天平(0～120 g，精度0.000 1 g)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；超聲波清洗器(SK250LH)，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司； 超純水器(EPED-10TS)，南京易普達(dá)科技發(fā)展有限公司；恒溫加熱器(COD)，青島路博偉業(yè)環(huán)保科技有限公司；水浴鍋(HH-S4型)，國(guó)立試驗(yàn)設(shè)備研究所(常州市)；型雙螺桿擠出造粒機(jī)(MEDU-22/40)，廣州市普同實(shí)驗(yàn)分析儀器有限公司；小型流延機(jī)(JYL-30)，佛山市金中河機(jī)械有限公司；涂布機(jī)(K202)，英國(guó)RK公司；馬弗爐(LT 40/11)，德國(guó)納博熱工業(yè)爐有限公司。

1.3 陽(yáng)性鋁塑復(fù)合膜的制備

考慮到市場(chǎng)上樣品中目標(biāo)物較難同時(shí)檢出，因此制備陽(yáng)性膜以便實(shí)驗(yàn)的開展。分別稱取EAD和OAD 1.0 g(精確到0.000 1 g)，與食品級(jí)PPH母粒998.0 g混合均勻后[25]，倒入造粒機(jī)重復(fù)造粒3次[26]，造粒時(shí)模頭溫度為170 ℃，料筒1～9區(qū)溫度分別為160、160、160、165、165、165、170、170和165 ℃，得到含EAD和OAD/PPH復(fù)合母粒。造粒完成后將復(fù)合母粒用小型流延膜實(shí)驗(yàn)機(jī)進(jìn)行流延成膜，流延機(jī)1～3區(qū)的溫度為180、185、190 ℃，合流區(qū)和模具區(qū)均是190 ℃，流延得到EAD和OAD /PPH復(fù)合膜。不添加2種化合物的空白PPH膜按照同樣的方法和條件制備。制成的薄膜厚度為(0.043±0.004) mm，密度為(0.956±0.057) g/cm3。

陽(yáng)性鋁塑復(fù)合膜由EAD和OAD/PPH復(fù)合膜與鋁箔利用膠黏劑復(fù)合而得，其制備方法如下：首先利用涂布機(jī)將膠黏劑均勻地涂在鋁箔層上，再利用一定的壓力將薄膜與鋁層復(fù)合，在復(fù)合的過(guò)程中將氣泡擠出，隨后放置在45 ℃的恒溫箱中干燥36 h，揮發(fā)掉溶劑，使其充分交聯(lián)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 色譜與質(zhì)譜條件

1.4.1.1 液相色譜條件

色譜柱InfinityLab Poroshell 120EC-C8(100 mm×3.0 mm,2.7 μm，美國(guó)Agilent公司)；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相用甲醇等梯度洗脫；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL；進(jìn)樣時(shí)間，4 min。

1.4.1.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(electron spray ionization, ESI)；掃描方式：正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè) (multiple reaction monitoring, MRM)；毛細(xì)管電壓4 000 V；干燥氣流速6 L/min；干燥氣溫度300 ℃；霧化器壓力45 psi；鞘氣溫度380 ℃；鞘氣流速11 L/min；其他主要質(zhì)譜條件見表1。

表1 EAD和OAD的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of EAD and OAD

1.4.2 樣品處理

為了避免實(shí)驗(yàn)工具帶來(lái)的EAD和OAD污染，實(shí)驗(yàn)過(guò)程避免使用塑料滴管、針式過(guò)濾器和注射器等塑料制品。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所使用玻璃器皿(量器除外)，洗凈后，置于馬弗爐400 ℃下燒制1 h，冷卻至室溫備用。

稱取0.1 g(精確到0.000 1 g，約0.2 cm×0.2 cm)陽(yáng)性鋁塑復(fù)合膜置于具塞玻璃試管中，加入10 mL乙醇室溫(30 ℃)下超聲提取1 h，重復(fù)提取2次，合并混勻，靜置后定容至25 mL，再用移液管取出5 mL提取液轉(zhuǎn)移至玻璃離心管，進(jìn)行高速離心，離心時(shí)間為5 min，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，待離心凈化后用玻璃滴管取上清液至進(jìn)樣小瓶，上機(jī)分析。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

準(zhǔn)確稱取EAD和OAD 0.010 0 g，用乙醇配制和稀釋成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保藏于4 ℃的冰箱中，經(jīng)過(guò)稀釋后配制成0.10、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50和3.00 mg/L的一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4.4 回收率及精確度

為了驗(yàn)證EAD和OAD提取方法的準(zhǔn)確性，選取空白鋁塑復(fù)合膜進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平分別為0.5、1.5、2.5 mg/L，每組實(shí)驗(yàn)6個(gè)平行樣，并做樣品空白。按照1.3.2對(duì)樣品進(jìn)行處理和上機(jī)分析，計(jì)算其回收率和精密度。

1.4.5 EAD和OAD含量的計(jì)算

EAD和OAD含量計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：X為樣品中EAD和OAD的含量， mg/kg；ρ為標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的樣品EAD和OAD質(zhì)量濃度， mg/L；ρ0為標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的空白樣品EAD和OAD質(zhì)量濃度， mg/L；V為定容體積， mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.4.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與圖像處理方法

Agilent LC-MS/MS Mass hunter工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Office軟件Excel和Origin 9.0對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖，Minitab 17 對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)。

答：抗疲勞的產(chǎn)品除了麥綠素，還有補(bǔ)氧膠丸，可以配合服用。睡眠不好，建議服用膠原蛋白肽。我注意到一些女士反映：本想用膠原蛋白肽美膚，卻發(fā)現(xiàn)睡眠好了。這是什么原理呢？原來(lái)，膠原蛋白肽是由眾多氨基酸組成的，而每三個(gè)氨基酸中就有一個(gè)甘氨酸，它在大腦細(xì)胞中是一種中樞神經(jīng)抑制性物質(zhì)，能讓人快速進(jìn)入深睡眠狀態(tài)，提高睡眠質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

EAD和OAD的分子中含有氨基，易結(jié)合H+，所以采用ESI正離子模式進(jìn)行檢測(cè)。首先在未接入色譜柱下，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，即以0.1 mL/min的流速注入1 mg/L的EAD和OAD混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在ESI正離子掃描模式下，進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描確定母離子；隨后，進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，確定子離子；最后，在MRM模式下對(duì)碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最終獲得如表1所示的質(zhì)譜條件。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)分別比較了甲醇、乙腈、0.1%甲酸甲醇、0.1%甲酸乙腈、甲醇-0.1%甲酸水(體積比為90∶10)、乙腈-0.1%甲酸水(體積比為90∶10)作為流動(dòng)相時(shí)色譜對(duì)EAD和OAD的分離效果及靈敏度的影響。結(jié)果表明，水相的加入對(duì)物質(zhì)分離存在負(fù)面影響，且靈敏度相對(duì)較低；甲醇作為流動(dòng)相時(shí)其靈敏度高于乙腈作為流動(dòng)相時(shí)的靈敏度，且噪聲較低。一般在正離子模式下，加入甲酸可使目標(biāo)物預(yù)形成[M+H]+，有助于促進(jìn)質(zhì)子離子化，從而提高響應(yīng)靈敏度[27]，但使用0.1%甲酸甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，目標(biāo)物的峰型和響應(yīng)值與甲醇作為流動(dòng)相時(shí)相比無(wú)明顯變化，因此本實(shí)驗(yàn)選擇純甲醇作為流動(dòng)相。

2.2.2 色譜柱的選擇

色譜柱的填料種類和顆粒大小是影響樣品組分分離度的主要因素。為獲得更高的分離度和靈敏度，本實(shí)驗(yàn)選取柱效較高，分離度較好的3種色譜柱進(jìn)行嘗試，A柱：Poroshell 120EC-C8(100 mm×3.0 mm, 2.7 μm)；B柱：Poroshell 120EC-C18(150 mm×3.0 mm, 2.7 μm)；C柱：ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)。結(jié)果表明，EAD和OAD在A柱上形成的色譜峰最佳，具有良好的分離度和響應(yīng)度。故最終選擇Poroshell 120EC-C8色譜柱，其混標(biāo)總離子流圖見圖1。

圖1 EAD和OAD混標(biāo)的總離子流圖(1 mg/L)Fig.1 Total ion chromatograms of EAD and OAD (1 mg/L)

2.3 樣品前處理方法優(yōu)化

超聲提取法可加快樣品中目標(biāo)物向溶劑中的溶出，從而實(shí)現(xiàn)提取效率的提高。超聲提取法依照1.4.2的步驟進(jìn)行超聲提取實(shí)驗(yàn)[11]。

溶解法通過(guò)溶劑將試樣溶解制成溶液，進(jìn)而使目標(biāo)物與原試樣分離。由于復(fù)合包裝材料中的PPH(熔點(diǎn)156 ℃)和鋁箔層(熔點(diǎn)660 ℃)熔點(diǎn)較高，采用二甲苯等有機(jī)溶劑加熱溶解提取目標(biāo)物很難進(jìn)行。稱取樣品0.1 g(精確到0.000 1 g，約0.2 cm×0.2 cm)于平底燒瓶中，加入25 mL二甲苯，在電熱板上加熱[24]，隨后將其定容至25 mL，取1 mL上清液氮吹干，再用1 mL乙醇復(fù)溶、振蕩、離心、上機(jī)分析。

回流萃取法通過(guò)萃取裝置進(jìn)行回流萃取，進(jìn)而分離出目標(biāo)物。稱取樣品0.1 g(精確到0.000 1 g，約0.2 cm×0.2 cm)于平底燒瓶中，加入攪拌子和25 mL二氯甲烷/環(huán)己烷混合試劑(體積比75∶25)，用回流萃取裝置攪拌回流90 min。完成回流萃取后將平底燒瓶連帶冷凝管從加熱板移開，待溶液冷卻至室溫后容至25 mL，取1 mL上清液氮吹干，再用1 mL乙醇復(fù)溶、振蕩、離心、上機(jī)分析[22]。

如圖2所示，超聲提取法對(duì)鋁塑膜中的EAD和OAD提取能力最好(P<0.05)。通常認(rèn)為將薄膜溶解可以促進(jìn)目標(biāo)物的溶出，但復(fù)合膜的熔點(diǎn)較高不易溶解，且目標(biāo)物難溶于二甲苯，因此溶解法在此較難進(jìn)行。故本實(shí)驗(yàn)選用超聲提取法。

圖2 前處理方法對(duì)復(fù)合膜中EAD和OAD提取能力的影響Fig.2 Effects of pretreatment methods on extraction capability of EAD and OAD from composite film

2.4 提取溶劑的優(yōu)化

基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用超聲提取法作為前處理方法，比較了甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、正己烷對(duì)陽(yáng)性鋁塑復(fù)合膜中EAD和OAD的提取效果，目的在于選取一種對(duì)陽(yáng)性鋁塑復(fù)合膜中的EAD和OAD均具有良好提取效果的溶劑。依照1.4.2的步驟選擇不同溶劑進(jìn)行超聲提取實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖3所示，乙醇對(duì)樣品中OAD的提取效果同其他4種溶劑存在顯著性差異(P<0.05)，故選擇乙醇作為提取溶劑。

圖3 提取溶劑對(duì)復(fù)合膜中EAD和OAD提取能力的影響Fig.3 Effects of extraction solvent on extraction capability of EAD and OAD from composite film

2.5 提取時(shí)間的優(yōu)化

選取乙醇為提取溶劑，對(duì)超聲時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。稱取0.1 g(精確到0.000 1 g，約0.2 cm×0.2 cm)于試管，加入10 mL乙醇，分別超聲提取20、30、40、50、60、70、80 min，將提取液定容至10 mL，離心后上機(jī)分析。如圖4所示，在超聲時(shí)間為20～60 min時(shí)，乙醇對(duì)樣品中EAD和OAD的提取效果隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；超聲時(shí)間為60 min時(shí)，EAD的提取效果達(dá)到最大值存在顯著性差異(P<0.05)；超聲時(shí)間超過(guò)60 min后，超聲時(shí)間對(duì)目標(biāo)物的提取能力無(wú)顯著增加。故選擇60 min作為最優(yōu)提取時(shí)間。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，OAD的提取效果較EAD的變化緩慢，這可能是因?yàn)镺AD分子質(zhì)量較小且分子鏈較短，大部分OAD在薄膜制備過(guò)程中已經(jīng)遷移到薄膜表面[5-7, 9]，因此薄膜表面的OAD可在短時(shí)間內(nèi)被超聲提取出來(lái)，而EAD則需要更長(zhǎng)的提取時(shí)間。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)復(fù)合膜中EAD和OAD提取能力的影響Fig.4 Effects of ultrasonic time on extraction capability of EAD and OAD from composite film

2.6 提取次數(shù)的優(yōu)化

以乙醇為提取溶劑，提取時(shí)間60 min為條件，對(duì)超聲提取次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，分別重復(fù)提取1、2、3和4次，合并后定容至40 mL，離心后上機(jī)分析。由圖5可知，2次重復(fù)提取效果比1次提取效果好，但繼續(xù)增加提取次數(shù)時(shí)，乙醇對(duì)EAD和OAD的提取效果無(wú)顯著性差異(P>0.05)，因此本文選擇重復(fù)提取2次為最優(yōu)提取次數(shù)。

圖5 超聲提取次數(shù)對(duì)復(fù)合膜中EAD和OAD提取效果的影響Fig.5 Effects of ultrasonic extraction times on extraction capability of EAD and OAD from composite film

2.7 方法驗(yàn)證

以EAD和OAD的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，建立工作曲線，結(jié)果表明，在0.1～3.0 mg/L的線性范圍內(nèi)兩者的質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。以信噪比S/N≥3為檢出限(limit of detection,LOD)，以S/N≥10為定量限(limit of quantitation,LOQ),具體數(shù)值如表2所示。

表2 EAD和OAD的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、方法檢出限和方法定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients, linearity range, LOD and LOQ of EAD and OAD

在加標(biāo)回收試驗(yàn)中，EAD和OAD的平均回收率為82%～116%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.1%～9.3%。結(jié)果表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，符合分析要求。

2.8 文獻(xiàn)中檢測(cè)方法比較

由表3列出的檢測(cè)方法與本文方法比較可知，這些檢測(cè)方法存在檢出限高、上機(jī)檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)和分離效果不佳等不足。因而本文在前人的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化檢測(cè)方法，通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜法建立了鋁塑復(fù)合膜中EAD和OAD含量的檢測(cè)方法，上機(jī)檢測(cè)時(shí)間為4 min，并且檢出限均≤0.02 mg/L。

表3 EAD和OAD的檢測(cè)方法Table 3 Detection methods of EAD and OAD

2.9 市場(chǎng)樣品的測(cè)定

在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下對(duì)市場(chǎng)上的11種鍍鋁復(fù)合膜和鋁塑復(fù)合膜中EAD和OAD的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如表4所示，11種樣品中均被檢測(cè)出EAD，5種樣品被檢測(cè)出OAD。80%被檢出OAD的樣品具有印刷層，因此被檢出的OAD可能來(lái)自于油墨。

表4 11種樣品信息和檢測(cè)結(jié)果(n=3)Table 4 11 kinds of sample information and test results(n=3)

3 結(jié)論

鋁塑復(fù)合材料具有良好的阻隔性。由于材料開口的困難，EAD和OAD常作為爽滑劑加入鋁塑復(fù)合膜中，但其可能向食品遷移。本研究建立了超聲提取-液質(zhì)聯(lián)用法快速檢測(cè)鋁塑復(fù)合膜中EAD和OAD的含量。該方法前處理簡(jiǎn)單，分離度較好，可在4 min內(nèi)上機(jī)快速檢測(cè)出EAD和OAD，2種物質(zhì)的檢出限均≤0.02 mg/L，定量限均≤0.05 mg/L，線性范圍為0.1～3.0 mg/L，優(yōu)于現(xiàn)有方法。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中，EAD和OAD的平均回收率為82%～116%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1%～9.3%。并檢測(cè)了市場(chǎng)銷售的11種鋁塑復(fù)合膜，其中EAD的檢出率為100%，OAD的檢出率為45.5%。通過(guò)比較分析7個(gè)檢測(cè)方法與本文檢測(cè)方法，本文檢測(cè)方法檢出限更低、上機(jī)檢測(cè)時(shí)間短、同時(shí)檢測(cè)EAD和OAD且分離效果好，可對(duì)市場(chǎng)中的鋁塑復(fù)合膜中EAD和OAD進(jìn)行定量分析。