混合乳酸菌發酵對桑葉中揮發性關鍵異味組分的影響

向敏，徐茂，王子涵，蔣和體

(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)

桑葉是桑科(Moraceae)桑屬(Moris)多年生木本植物桑樹的主要產出物。早在1993年我國國家衛生部公布桑葉為藥食兩用植物，桑葉營養物質豐富且具有多重藥理作用[1-3]。桑葉生長快，繁殖期短，年產量可達2 kg/m2，然而只有1%～3%的桑葉資源被利用。因此，開發利用桑葉資源具有重要意義[4]。

近十幾年來,國內外許多學者在桑葉與健康、桑葉與食品開發等方面進行了大量的研究。已開發出桑葉茶、桑葉咀嚼片、桑葉干粉、桑葉營養素等食品和保健品[5]。但是在開發桑葉食品的過程中，發現一個普遍的問題，桑葉揮發性成分復雜, 存在較重的草腥味，導致部分人群對其難以接受，阻礙了其在食品領域的發展。

近年來，益生菌發酵技術得到了長足的發展。有研究表明，果蔬經過乳酸菌發酵之后，不僅能使果蔬功能性成分較好保留且能對果蔬揮發性風味物質的種類和含量造成較大改變[6]。徐慧鈺[7]利用植物乳酸菌發酵將柚子汁中的苦味物質柚皮苷轉化為沒有苦味的柚皮素。從而達到對柚子汁的脫苦效果，使得柚子汁的風味得到改善；劉瑩等[8]研究發現，通過乳酸菌發酵不僅能去除胡蘿卜原漿中令人不愉快的藥腥味且會產生許多芳香物質和營養物質。SHANG等[9]利用乳酸菌發酵去除木瓜澀味，為解決水果的澀味問題提供了一種自然的方法。李彤等[10]利用乳酸菌發酵復合豆乳發現，發酵后豆乳中醇、酸、酯類等香氣成分顯著增加,有利于降低豆乳豆腥味。

目前尚未有文章研究引起桑葉草腥味的具體物質，也未見利用乳酸菌發酵的方式去除桑葉草腥味的報道，因此，本研究利用氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS), 氣相色譜嗅聞法(gas chromatography olfactometry，GC-O)等手段跟蹤發酵過程中揮發性風味物質變化，分析乳酸菌發酵對桑葉草腥味的影響，并初步鑒定出新鮮桑葉中產生草腥味的物質。利用主成分分析法研究桑葉不同發酵階段風味物質的差異性，找出對風味貢獻最大的物質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉，品種為金強，選取健康無蟲蛀病變10月份的葉片；NaCl(分析純)，重慶川東化工集團有限公司；短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，中國微生物菌種保藏中心；2-辛醇(內標)，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設備

VD-650超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；HH.BLL.600-S電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠；SYQ-DSX-280B高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；GC-MS2010氣相質譜聯用儀，日本島津公司；固相微萃取，美國 Supelo 公司；Sniffer 9000 嗅味檢測儀，瑞士 Brechbühler 公司；DK-8D 三孔電熱恒溫水槽，上海齊欣科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 桑葉發酵

將新鮮桑葉[水分、蛋白質(以干物質計)、多糖、粗纖維質量分數分別為77.25%、18.29%、208.72 mg/g、13.25%]清洗干凈，剪切成2 cm寬條狀后放入100 mL錐形瓶中(投葉量為10 g)，加入5%(濕基)葡萄糖和60 mL純水，新鮮桑葉經滅菌處理(102 ℃ 20 min)后，得到未發酵桑葉樣品，放至室溫，接種5%(濕基)短乳桿菌∶腸膜明串珠菌=1∶1混合菌液,在30 ℃恒溫培養箱中培養48 h[11]。

1.3.2 揮發性物質的提取

分別稱取 5.0 g 發酵0、24、36、48 h桑葉樣品置于20 mL螺口頂空樣品瓶中，加入2 mL飽和NaCl溶液以加速揮發性成分的擴散。再向瓶內加入10 μL 2-辛醇(0.5 g/L)標準品作為內標物，用聚四氟乙烯隔墊密封，將100 μm PDMS萃取頭插入萃取瓶中，于60 ℃水浴中平衡10 min后開始萃取，頂空吸附40 min。然后在GC-MS進樣口250 ℃解吸5 min，同時啟動儀器采集數據。

1.3.3 GC-MS分析條件

色譜條件:色譜柱為DB-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序為柱溫箱起始溫度為40 ℃,保持2 min,先以5 ℃/min升溫到120 ℃,保持2 min,4 ℃/min升溫到180 ℃,保持2 min,再以6 ℃/min升溫到250 ℃,保持5 min;載氣為高純He,流速1 mL /min,壓力49.5 kPa;進樣口溫度250 ℃; 柱流量1 mL/min;不分流進樣。

質譜條件:電子轟擊離子源;離子源溫度230 ℃;接口溫度250 ℃;溶劑延遲時間3 min; ACQ方式為Scan;質量掃描范圍m/z40～400。

1.3.4 揮發性成分的定性與定量分析

標準譜庫NIST08、NIST08s和NIST14、NIST14s對化合物進行檢索匹配，選擇匹配度>80的物質并參考相關文獻定性,以內標法定量。

1.3.5 GC-O分析

本試驗采用強度法[12]對新鮮桑葉揮發性風味物質進行GC-O分析。嗅辨儀器條件：嗅味檢測儀的傳輸線溫度220 ℃,用 16 mL/min的濕潤空氣作為嗅聞載氣。固定3名聞香員，平均每人嗅聞2次。每次運行分析程序時，聞香員需全程嗅聞，并記錄氣味成分的保留時間、氣味特征與氣味強度。根據 0 表示無氣味、 1表示氣味微弱、 2表示氣味中等、 3表示氣味較強、 4表示氣味非常強來打分。將6次嗅聞中重復出現4次的嗅聞記錄作為最終結果,氣味活度值計算[13]如公式(1)所示：

(1)

1.3.6 風味感官評價

確定7個主要風味指標，分別是腐臭味、酸味、青草味、蘑菇味、花香、果香、豆腥味，進行了風味剖面分析[14]。感官鑒評人員由10位食品專業學生組成，他們都熟悉桑葉的風味。感官評價員嚴格按照表1感官評價標準依次對各氣味特征進行打分[15]；將待測樣品放置于小樣品杯中，樣品溫度保持在30 ℃左右。總分采用5分制原則，0分代表沒有該氣味；3分代表該氣味強度中等；5分代表該氣味極強，綜合取平均值，將其結果繪制成雷達圖。

表1 感官評價參照標準Table 1 Reference standard of sensory evaluation

1.4 數據處理

利用Excel 2013進行數據整理及計算，SPSS 19.0進行數據統計分析，Origin 8.1進行作圖。

2 結果與分析

2.1 桑葉發酵時間的確定

OD600是追蹤液體培養物中微生物生長的標準方法，其可以評價乳酸菌在該條件下的成長情況[16]。由圖1可知，發酵液中OD600值在48 h達到峰值，隨發酵的不斷進行，總酸不斷積累，pH值也會隨之降低，高濃度總酸具有反饋抑制作用，抑制了乳酸菌的生長繁殖。發酵液中總酸含量在36 h后趨于平緩，可能是由于發酵36 h后高濃度總酸抑制了乳酸菌的生長，導致其產酸量下降。綜合考慮，本實驗將分析桑葉0～48 h桑葉發酵樣品中的揮發性風味成分。

圖1 發酵時間對OD600值與總酸含量的影響Fig.1 Effect of fermentation time on OD600value and total acid content

2.2 發酵過程中桑葉的感官評價分析

如圖2所示，桑葉乳酸菌發酵的各個階段感官品質存在較大差異。發酵0 h桑葉的青草味、蘑菇味占主導地位，并伴有豆腥味。發酵24 h青草味、蘑菇味、豆腥味有所減弱，并增加了輕微花香和果香。發酵36 h花香和果香味占主導地位并伴隨輕微的酸味，而青草味、豆腥味消失，蘑菇味大幅度下降。發酵48 h花香和果香占主導地位，并產生微弱的腐臭味和酸味，青草味、豆腥味和蘑菇味消失。這表明，乳酸菌發酵使得桑葉中青草味、腥味物質向花果香、甜香等物質轉化。但發酵時間不應過長，否則會產生大量的帶有汗臭味和腐臭味的物質。有研究表明不同發酵時間段的不同香型強度變化與揮發性化合物的組成和含量存在一定相關性[17]。

圖2 不同發酵階段桑葉感官評價雷達圖Fig.2 Radar charts for sensory evaluation of mulberry leaves at different fermentation stages

2.3 發酵過程中桑葉揮發性風味物質的比較分析

由不同發酵階段桑葉的總離子流程圖(圖3)可知，不同發酵階段桑葉中揮發性物質存在明顯差異，表明桑葉在發酵過程中其揮發性成分發生了動態變化。由揮發性組分的鑒定結果(表2)可知，從發酵0、24、36、48 h桑葉中共鑒定出116種揮發性物質，主要包括烴類26種，醇類23種，醛類17種，酮類10種，酯類26種，酚類4種，酸類6種和其他類化合物4種。0、24、36、48 h分別檢測出49、42、53、61種揮發性物質。

發酵前桑葉中的酯類化合物總量為5.29%，共6種。發酵過程中酯類化合物含量和種類隨著發酵時間的延長逐漸增加，在36 h達到峰值，分別為28.93%和17種。這表明乳酸菌發酵過程中產生酸類化合物與醇類化合物發生某種酯化反應生成大量酯類化合物[18]。酯類物質一般呈果香味[19]。發酵桑葉中新增含量最多的酯類為水楊酸甲酯，其天然存在于冬青油、櫻桃、蘋果等水果的果汁中，具有冬青葉香味與果香味。其次是具有白蘭地酒香氣的辛酸乙酯，以及己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸芐酯等具有花香和果香的酯類，其中短碳鏈的脂肪酸酯類在常溫中易揮發，因而具有較大的風味貢獻潛力。

醇類物質含量在發酵過程中呈現先上升后下降的趨勢，并在36 h達到峰值，為20.2%，與0 h相比增加了32.43%，且種類差異較大。通過微生物發酵可以利用氨基酸代謝產生醇類物質[18]。不飽和醇閾值較低，氣味明顯[20]。C6醇是果蔬中青味主要來源[21]。其中順式-3-己烯醇、3-辛醇在0 h含量較高，但在之后的發酵過程中未檢測到，順式-3-己烯醇具有強烈的青草味、3-辛醇具有油脂味和草藥味。1-辛烯-3-醇、2-乙基己醇在整個階段均有檢出且隨著發酵時間的延長逐漸降低。1-辛烯-3-醇具有土腥味和蘑菇味。與0 h相比，發酵36 h時，新增加且含量較高的揮發性物質為具有蘋果白蘭地香氣的異戊醇、芳香氣味的苯甲醇、玫瑰樣花香的苯乙醇以及鈴蘭香氣的芳樟醇。說明通過乳酸菌發酵可降低桑葉中的青草味和腥味，并產生花香果香等令人愉悅的香氣成分，與感官評定結果一致。

與0 h相比，發酵過程中醛類、烷烴類化合物整體呈現下降趨勢，且種類差異較大。整個發酵過程均有檢出的化合物為壬醛和癸醛。醛類化合物呈現的氣味特征與濃度有關，具有很強的氣味疊加效應[22]，高濃度的醛類物質會帶來異味[23]，而且醛類物質是不穩定的化合物，特別是在微生物作用下，在食品基質中會被還原為醇或被氧化為酸[24]。這可以解釋發酵后的桑葉中醛類物質相對含量低而醇類和酸類物質相對含量高。烷烴類化合物的閾值一般較高，所以對風味的貢獻較小。

酚類、酸類及酮類化合物含量在發酵過程中持續增加，其中丁香酚是主要的酚類物質，在整個發酵過程均有檢出且隨著發酵的進行含量持續增加，其具有濃郁的丁香花香，是發酵桑葉主要的呈味物質。少量的酸類物質對桑葉青草味具有掩蓋作用[25]，但發酵時間過長會產生大量的辛酸、己酸等具有汗臭味和辣味的酸類化合物。所以適度發酵會改善桑葉的感官品質而過度發酵反而會使桑葉的感官品質降低，這與感官評價結果一致。酮類來源于醛類物質的進一步氧化、氨基酸分解或微生物氧化[26]，這也是發酵過后酮類化合物顯著性增加的原因(P<0.05)。發酵36 h時，甲基庚烯酮是主要的酮類化合物，其含量占同時期酮類化合物的58.96%，具有濃郁的水果香味，這也是桑葉發酵后重要的呈味物質，對發酵后桑葉風味的形成具有重要作用。

圖3 桑葉不同發酵階段的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatograms of mulberry leaves during different fermentation periods

2.4 桑葉中特征性風味物質分析

食物會產生許多揮發性化合物，但并不是所有成分都對香味有貢獻。大多數情況下，色譜圖中最強的峰對食品香味貢獻反而不大，而小峰物質對香味影響大，因此色譜峰的強度并不能反映各組分對香味貢獻的實際情況。所以需要引入香氣活度值(odor activity value,OAV)的概念，將物質濃度和感覺閾值結合起來，對物質氣味作出評價。當物質的OAV>1時，該物質可能對食品總體氣味有直接影響，且在一定范圍內，OAV越大說明該組分對總體氣味貢獻越大[30]。由表3可知，未發酵桑葉中OAV>1的風味化合物按OAV值從大到小依次為1-辛烯-3-醇>肉豆蔻醛>丁香酚>辛醇>壬醛>反-2-辛烯醛>癸醛>β-環檸檬醛>順式-3-己烯醇。這些物質多呈青草味和腥味，所以未發酵桑葉具有強烈令人不愉快的草腥味。通過乳酸菌發酵之后，呈現青草味和腥味的物質含量顯著性降低(P<0.05)，轉而增加了呈現濃郁花香、果香的芳樟醇、壬醇等醇類和己酸乙酯、癸酸乙酯等酯類化合物,且具有強烈丁香花氣味的丁香酚含量顯著性增加(P<0.05)，成為發酵桑葉中OAV最高的化合物，直接影響了發酵桑葉的揮發性風味。

表2 桑葉揮發性風味物質在發酵中的變化 單位/%

表3 主體風味物質的OAV 單位：μg/kg

2.5 未發酵桑葉的GC-O結果分析

通過 GC-O 嗅辨實驗，在未發酵桑葉中共鑒定出11種帶有明顯氣味且能與GC-MS結果匹配的物質和1種未知、被感官評定員嗅聞到但卻無法與儀器檢測結果相對應的物質。可能因為這種物質含量極低，但它的閾值也很低，所以儀器無法對其進行檢測，但能被感官鑒評員所感受到[31]，其中包含醇類物質4種、醛類物質5種、酚類物質1種和酯類物質1種，醇類和醛類化合物相對含量占所有氣味活性成分的91.12%，其對未發酵桑葉風味起主導作用。如表4所示，通過GC-O嗅辨出的帶有青草味和腥味的物質有順式-3-己烯醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、癸醛、肉豆蔻醛。其中具有青草味的順式-3-己烯醇、肉豆蔻醛在發酵后消失，而壬醛、癸醛含量呈先上升后下降的趨勢。1-辛烯-3-醇在整個發酵過程中均有檢出并且隨著發酵的進行含量逐漸降低，與未發酵桑葉相比，發酵48 h桑葉中1-辛烯-3-醇含量減少96.11%。反-2-辛烯醛在發酵24 h略有增加，之后未檢測到。因此可以認為桑葉中的青草味和腥味是順式-3-己烯醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、癸醛、肉豆蔻醛共同作用的結果。結合OAV可知，這幾種物質對風味的影響程度從大到小依次是1-辛烯-3-醇>肉豆蔻醛>壬醛>反-2-辛烯醛>癸醛>順式-3-己烯醇。

表4 未發酵桑葉揮發性成分GC-O嗅辨結果Table 4 GC-O smelling results of volatile components in unfermented mulberry leaves

2.6 桑葉發酵過程中揮發性物質主成分分析

以桑葉不同發酵階段7 類揮發性物質的相對含量為指標，用SPSS 進行主成分分析(principal component analysis，PCA)，得到各主成分的特征值、方差貢獻率、累計方差貢獻率。結果如表5 所示，提取到特征值>1的2個主成分，且這2個主成分的方差累計貢獻率達到87.285%，表示能夠解釋桑葉不同發酵階段香氣大部分的成分信息，因此，選擇這2個主成分進行風味品質分析。

桑葉不同發酵階段樣品中7類揮發性物質的載荷分析如圖4所示，酯類和醛酮類作為主要揮發性物質與PC1 高度正相關(載荷系數分別為0.995、0.814)，酚類與PC1呈高度負相關(載荷系數為-0.982)；PC2中載荷最高的正相關揮發性物質為醇類(載荷系數為0.982)。上述結果說明醛類、酯類、醇類以及酚類物質是不同發酵階段樣品中含量發生顯著變化的揮發性物質。

不同發酵階段樣品的得分如圖5所示，第一主成分得分較高的為36 h發酵樣品和48 h發酵樣品，影響它們的主要揮發性成分為醛類、酯類和酚類物質，它們可能決定了36 h發酵樣品和48 h發酵樣品的風味特征；0 h發酵樣品在第一主成分上得分最低，其單獨位于第二象限，PC1可以將它與其他3種樣品完全區分開。根據距離的遠近，發酵各個時間段揮發性物質存在較大差異。即PCA可以對桑葉不同發酵階段樣品進行有效區分。

表5 主成分的特征值及方差貢獻率Table 5 Eigenvalues of principal components and variance contribution rate

圖4 不同發酵時間樣品中7類揮發性物質的載荷分布圖Fig.4 Load distribution of 7 types of volatile substances in samples at different fermentation times

圖5 不同發酵時間樣品的得分圖Fig.5 Score graphs of samples with different fermentation times

3 結論

通過GC-O實驗結合香氣活度值可以鑒定出桑葉中呈現草腥味的物質為順式-3-己烯醇、1-辛烯-3-醇、反-2-辛烯醛、壬醛、癸醛、肉豆蔻醛。并且通過對不同發酵階段桑葉的揮發性成分進行分析可知，桑葉在不同發酵時段的揮發性風味物質種類和含量均處于動態變化中，且整體風味是由青草味、蘑菇味、腥味向花香、果香等香味轉化而來。通過主成分分析可知，桑葉不同發酵樣品中含量發生顯著變化的揮發性物質是醛類、酯類、醇類以及酚類物質。得分較高的是36 h發酵樣品。說明通過主成分分析法研究桑葉不同階段發酵風味物質的差異性，找出對風味貢獻最大的物質是可行的。該研究結果可為提高桑葉的食用價值和定向加工技術等提供重要科學依據。