細胞電生理虛擬仿真實驗的設計與實現

劉 惺， 漢建忠， 何曉凡， 張居華

（中南大學a.基礎醫學院；b.資產與實驗室管理處，長沙410013）

0 引 言

細胞生物電的形成機制是所有醫學生必須掌握的重要基本理論。有關細胞電生理的研究，曾先后獲得1963年和1991 諾貝爾生理學或醫學獎［1］?？茖W家開創的電壓鉗和膜片鉗實驗技術，使單細胞乃至單個離子通道的生物電觀測成為可能，開辟了人類認識微觀世界的新時代［2］。

電壓鉗和膜片鉗實驗是醫學生透徹理解生物電形成機制的重要手段。但是在真實實驗中，采用的儀器精密貴重，操作難度極大，其技術培訓至少需要3 ～6個月，一次耗時10 h 左右，無法在本科教學實驗中直接應用［3］。因此，研發電生理相關虛擬實驗開展教學是一種很好的方式。

1 實驗設計

1.1 基本原理

細胞膜電位是指細胞膜兩側的跨膜電位差，分為靜息條件下的靜息電位（Resting Potential，RP）和興奮條件下的動作電位（Action Potential，AP）（見圖1）。細胞跨膜電位的產生原因：①細胞膜兩側鈉、鉀離子濃度分布不均所推動的跨膜離子流動；②在不同狀態下，細胞膜上各種離子通道的開放差異所決定了膜對各種離子的通透性的不同。其細胞膜電位數值（Vm）可用Goldman公式表示［4-7］：

式中：R為氣體常數；T為絕對溫度；F 為法拉第常數；PK為膜對［K＋］的通透性；PNa為膜對Na＋的通透性；［K＋］1和［K＋］0分別為細胞內和細胞外K＋濃度；［Na＋］1和［Na＋］0分別為細胞內和細胞外Na＋濃度。

圖1 神經纖維動作電位模式圖

1.2 實驗模塊及仿真設計思路

1.2.1 細胞靜息電位測定及影響因素

RP是指細胞未受刺激時，存在于細胞膜內外兩側的外正內負的電位差［8-9］。RP 的大小取決于細胞內、外K＋的濃度和細胞膜PNa／PK的比值的影響［10］。

實驗通過人為設定不同的細胞外的K＋濃度，細胞膜對鈉鉀通透性在特定范圍內隨機設定，利用goldman公式得出對應細胞RP值，以模擬真實情況下的RP的測定情況。在得出多組細胞外不同濃度梯度K＋情況下的RP的統計學結果后，將結果代入細胞外鉀濃度與RP 的半對數坐標圖中，觀察細胞外鉀濃度與RP的關系。并與不同細胞膜PNa／PK的比值情況下理論計算曲線進行擬合，得出最佳擬合狀態時的細胞膜PNa／PK的比值。使學生對的形成機制產生直觀清晰的認識［11-12］。設計思路如圖2 所示。

圖2 細胞RP測定及影響因素仿真設計思路

1.2.2 細胞動作電位測定及影響因素

AP是指可興奮細胞受到刺激時在RP 的基礎上產生的膜電位的快速倒轉與復原。AP 的幅度主要決定于細胞內外的鈉離子濃度差，以及PNa／PK的比值（見圖3）。

圖3 細胞AP測定及影響因素仿真設計思路

1.2.3 Hodgkin 電壓鉗實驗

Hodgkin 電壓鉗技術通過對Hodgkin 電壓鉗實驗［13］中獲取的真實數據建立數學模擬。分別測定在不同膜電位水平條件下跨細胞膜的鈉電流和鉀電流的變化，或細胞膜鈉電導（GNa）和鉀電導（GK）的變化，分別定量反映PNa和PK的大小及在不同條件下的變化（見圖4），比較鈉電導（GNa）和鉀電導（GK）的變化異同，歸納出鈉通道、鉀通道開放的規律，進一步在鈉通道、鉀通道水平深刻理解RP、AP 的形成機理，設計原理如圖5 所示。

圖4 不同細胞膜電壓鉗制水平對鈉電導（GNa）和鉀電導（GK）的影響

圖5 Hodgkin 電壓鉗實驗仿真設計思路

圖6 仿真實驗開始界面

2 實驗實現

2.1 實驗過程步驟

學生登錄該虛擬仿真實驗教學項目后，分別可見“靜息電位的測量與及其影響因素”“動作電位的測量與及其影響因素”及“Hodgkin 電壓鉗模擬實驗”3 個模塊。分別點擊可進入各個模塊（見圖6）。

2.1.1 RP的測量及其影響因素實驗

步驟1選擇“目的及原理”，進行預習。點擊“開始實驗”進入實驗。

步驟2參照正常血鉀濃度設定細胞外鉀離子濃度［K＋］0為5 mmol／L，通過鍵盤方向鍵操控微電極上下左右移動，分別插入5 個虛擬細胞，得到5 個不完全相同的RP數據，計算并記錄均數及標準誤。

步驟2分別在0.5 ～5 mmol／L范圍內任意設定［K＋］0，重復上述操作，計算各［K＋］0時RP 的均數，得到并記錄［K＋］0在0.5 ～5 mmol／L變化時相應RP數據。

步驟3點擊“結束輸入”后，選擇“數據分析”，在相應的坐標系中按照所設定的［K＋］0輸入相應的RP均數及標準誤數值，可顯示一系列散點圖，顯示RP隨［K＋］0變化的趨勢，可歸納出決定RP 大小的主要因素是細胞外鉀離子濃度［K＋］0。

步驟5分別設置不同鈉鉀通透性比值（PNa／PK）對上述散點圖進行曲線擬合。參照正常安靜狀態下細胞膜鈉、鉀通透性比值（PNa／PK）為0.01 ～0.02，設置PNa／PK為0.01，獲得的擬合曲線與實際散點圖的變化趨勢有一定差異。如果將PNa／PK變小，則擬合曲線更接近散點圖的變化趨勢，而若將PNa／PK變大，則擬合曲線與實際散點圖的變化趨勢差異增大，選擇平均離均差平方和最小的PNa／PK，即得到曲線與散點圖的最佳擬合狀態。點擊“結果分析”，系統自動給出結論。由此，歸納出PNa／PK是影響RP 的另一重要因素（見圖7）。

圖7 實驗結果分析

2.1.2 AP的測量及其影響因素實驗

實驗步驟與2.1.1 基本相同。學生可歸納出AP發生時，細胞膜主要對Na離子通透，對K離子的通透性相對較小，其比值在20∶1左右（見圖8）。

圖8 動作電位測定操作及結果

2.1.3 Hodgkin電壓鉗模擬實驗

步驟1預習相關知識后，進入數據測量實驗界面。

步驟2分別設置初始電位，計劃鉗制到的膜電位水平，鉗制持續時間等參數、生成波形（見圖9）。

步驟3分別完成去除鈉、鉀電流操作（見圖10）。

圖9 實驗參數設置以及膜電流顯示結果

圖10 去除鈉、鉀電流顯示的結果

步驟4選擇“顯示電導”，顯示GNa和GK，點擊“生成波形”，展現GNa和GK依時間的變化情況，歸納出規律1：去極化可引起GNa和GK的增大，但GNa增高快而GK增高慢（見圖11）。

步驟5設置不同鉗制持續時間，可見GNa依然在增大后立即變小，而GK的增大依然只要細胞膜去極化就一直保持增高。得出規律2：鈉通道開放后自動關閉，而鉀通道開放后的關閉取決于膜電位的恢復（見圖12）。

步驟6保持初始電位和鉗制時間不變，改變膜＼電位的鉗制水平，可以得到一系列相應的GNa曲線（綠色）和GK曲線（藍色）。得出規律3：GNa和GK都因為去極化程度的增大而增大（見圖13）。

圖11 以膜電導顯示結果

圖12 不同鉗制持續時間對鈉電導、鉀電導的影響

圖13 不同始膜電位水平對鈉電導、鉀電導的影響

步驟7將鉗制膜電位水平和鉗制持續時間固定不變，逐漸梯度改變初始膜電位水平，觀察將細胞膜電位從不同初始膜電位水平鉗制到某一固定膜電位時GNa和GK曲線變化的情況，得出規律4：鈉通道開放的數量受激活前膜電位的影響，而鉀通道的激活無此特性（見圖14）。

圖14 不同膜鉗制電位水平對Na ＋、K ＋電導的影響

3 結 語

（1）本實驗將真實的細胞電生理研究內容轉化為虛擬實驗教學項目，通過虛擬仿真技術的呈現，創立虛擬儀器，進行虛擬操作，以虛補實解決了在實驗教學中無法開展細胞水平電生理實驗的難題，大大拓展了實驗教學內容的廣度和深度［14］。

（2）實驗過程具有高度交互的人機對話和逼真的數據體驗，使學生能夠享受模擬操作、數據分析、邏輯推理帶來的樂趣。

（3）實驗內容開放，實驗參數可任意設置，可以再現實驗數據的整理、信息的挖掘和實驗結論的歸納過程，踐行了以學生為中心的教育理念［15］。