二苯乙烯苷對人乳腺癌T-47D細胞增殖及其雌激素受體表達的影響

朱璨 王嫣 李堯鋒 付云燕 唐文超 楊長福 王和生

摘 要 目的：研究二苯乙烯苷（TSG）對人乳腺癌T-47D細胞增殖及其雌激素受體（ER）表達的影響，探討其雌激素樣作用及可能機制。方法：以ER陽性人乳腺癌T-47細胞為對象，以β-雌二醇（β-E2，1×10-8 mol/L）為陽性對照，采用CKK-8法檢測不同濃度TSG（1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4 mol/L）作用24、48、72 h后的細胞增殖情況，并計算增殖率;分別采用Western blotting法和逆轉錄-聚合酶鏈式反應法檢測經低、中、高濃度TSG（1×10-8、1×10-6、1×10-4 mol/L）作用48 h后細胞中ER-α、ER-β蛋白及其mRNA的表達情況。結果：經不同濃度TSG作用24、48、72 h后，各給藥組各時間點（除β-E2組48 h外）的細胞增殖率均較空白組顯著升高，且TSG 1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L組顯著高于β-E2組（P<0.05或P<0.01）。經低、中、高濃度TSG作用48 h后，各給藥組細胞中ER-α、ER-β蛋白及其mRNA的表達量均較空白組顯著升高（P<0.05或P<0.01）;且TSG低濃度組ER-β蛋白的表達量，各濃度組細胞中ER-α mRNA以及低、高濃度組ER-β mRNA的表達量均顯著高于β-E2組（P<0.05或P<0.01）。結論：TSG可誘導T-47D細胞的體外增殖，并可通過促進ER-α、ER-β蛋白及其mRNA的表達來發揮雌激素樣作用;這種作用在一定濃度下強于β-E2。

關鍵詞 二苯乙烯苷;植物雌激素;人乳腺癌T-47D細胞;細胞增殖;雌激素受體

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the effects of stilbene glucoside （TSG） on the proliferation and estrogen receptor （ER） of human breast cancer T-47D cells， and to explore its estrogen-like effect and potential mechanism. METHODS： Taking ER positive human breast cancer T-47D cells as subjects， using β-estradiol （β-E2，1×10-8 mol/L） as positive control， CCK-8 assay was used to detect the cell proliferation after treated with different concentrations of TSG （1×10-8， 1×10-7， 1×10-6， 1×10-5， 1×10-4 mol/L） for 24， 48， 72 h; the cell proliferation rate was calculated. Western blotting assay and RT-PCR methods were adopted to detect the protein and mRNA expression of ER-α and ER-β in cells after treated with low， medium and high concentrations of TSG （1×10-8， 1×10-6， 1×10-4 mol/L） for 48 h. RESULTS： After treated with different concentrations of TSG for 24， 48， 72 h， the cell proliferation rate of each administration group at each time point （except for β-E2 group at 48 h） increased significantly， compared with blank group; those of TSG groups （1×10-5， 1×10-6， 1×10-7 mol/L） were significantly higher than β-E2 group （P<0.05 or P<0.01）. After treated with low， medium and high concentrations of TSG for 48 h， protein and mRNA expression of ER-α and ER-β in cells were increased significantly， compared with blank group （P<0.05 or P<0.01）; protein expression of ER-β in TSG low concentration group， mRNA expression of ER-α in TSG groups as well as mRNA expression of ER-β in TSG low and high concentration groups were significantly higher than β-E2 group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： TSG can induce the in vitro proliferation of T-47D cells and exert estrogen-like effects by promoting protein and mRNA expression of ER-α and ER-β， which is stronger than that of β-E2 at a certain concentration.

KEYWORDS ? Stilbene glucoside; Phytoestrogen; Human breast cancer T-47D cells; Cell proliferation; Estrogen receptor

二苯乙烯苷化學名為2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷（2，3，5，4′-tetrahydroxystilbene-2-Ο-β-D-glucoside，以下簡稱“TSG”），易溶于水，是中藥制首烏的主要活性成分，且其含量是制首烏質量控制的專屬性指標[1]。制首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.干燥塊根的炮制加工品，具有補肝腎、益精血、壯筋骨、烏須發之效[1]。現代藥理研究表明，制首烏及其活性成分TSG具有抗衰老、防治骨質疏松、改善血管性癡呆等作用[2-3]。本課題組前期發現，制首烏具有植物雌激素樣作用，其水煎劑可調節去卵巢大鼠的生殖軸，亦能抑制雷公藤多苷對大鼠生殖功能的破環，且制首烏含藥血清可促進人乳腺癌T-47D細胞的增殖[4-6];且前期體內實驗還發現，TSG能增加性未成熟小鼠的子宮系數，調節性激素水平，增強子宮雌激素受體（ER-α、ER-β）的表達，亦提示TSG具有雌激素樣活性[7]。基于此，本課題組擬研究TSG對雌激素受體陽性[ER（+）]人乳腺癌T-47D細胞增殖及其ER表達的影響，以進一步探討TSG的雌激素樣作用及分子機制，為制首烏植物雌激素樣作用的物質基礎研究和臨床應用提供實驗依據，為雌激素依賴性腫瘤（如乳腺癌、子宮內膜癌）患者的治療提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Eclipse TS100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）;Synergy 2型熒光/吸收光酶標儀（美國BioTek公司）;BB15型CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;Mini-PROTEAN Tetra型電泳槽、ChemicDoc Touch型超高靈敏化學發光成像系統、C1000 Touch Thermal Cycler型聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）;NanoPhotometer型超微量分光光度計（德國Implen公司）;Mi- crofuge 20R型高速冷凍離心機（美國Beckman 公司）。

1.2 藥品與試劑

TSG對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：J17O8Z45941，純度：99.9%）;β-雌二醇對照品（β-E2，陽性對照，北京索萊寶科技有限公司，批號：521C022，純度：≥98.0%）;DMEM高糖培養液、無酚紅DMEM高糖培養液、胰蛋白酶（美國Gibco公司，批號分別為8118240、2003881、1967534）;胎牛血清（FBS）、活性炭-葡聚糖苷處理的胎牛血清（CDT-FBS，以色列Biological Industries公司，批號分別為1829596、1742900）;兔源β-肌動蛋白（β-actin）、ER-α抗體（美國CST公司，批號分別為4、6）;兔源ER-β抗體（美國Abcam公司，批號：GR3211677-6）;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（H+L）二抗（美國Jackson Immuno Research公司，批號：139799）;青-鏈霉素雙抗、CCK-8試劑盒、細胞裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS- PAGE）凝膠配制試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL化學發光試劑盒、快速封閉液（上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為091818180923、013018181008、082018180910、081518180916、103018181030、0710181- 80906、110818181108）;TRNzol Universal總RNA提取試劑、FastKing一步法逆轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，批號分別為R6917、Q6214];PCR引物（序列及擴增片段長度見表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司設計、合成;二甲基亞砜（DMSO）等試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 細胞

ER（+）人乳腺癌T-47D細胞株由上海復祥生物科技有限公司提供。

2 方法

2.1 細胞培養及預處理

將T-47D細胞置于含10%FBS、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養液中，于37 ℃、5%CO2、相對飽和濕度的條件下培養（培養條件下同）。于試驗開始前3 d，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）清洗2次后，替換為含5%CDT-FBS、1%青-鏈霉素雙抗的無酚紅DMEM高糖培養液繼續培養，以進一步增加細胞對雌激素樣物質的敏感性[8]。

2.2 細胞增殖情況檢測

采用CCK-8法檢測。取“2.1”項下經培養且處于對數生長期的細胞適量，用PBS清洗2次，經0.25%胰蛋白酶消化后，以不含血清的DMEM高糖培養液調整細胞密度，并按1×103個/孔接種于96孔板中，每孔總體積為150 μL。培養24 h待細胞貼壁后，將其隨機分為空白組、β-E2組[1×10-8 mol/L，以含DMSO、5%CDT-FBS、1%青鏈霉素、雙抗的無酚紅DMEM高糖培養基稀釋（DMSO最終體積分數為0.000 3%），濃度參考文獻方法[9]和本課題組前期預試驗結果設置;下同]和TSG不同濃度組（1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8 mol/L，濃度參考本課題組前期預試驗結果設置），每組設6個復孔。吸棄上清液，空白組加入含5%CDT-FBS、1%青-鏈霉素雙抗的無酚紅DMEM高糖培養液150 μL，各給藥組加入含相應藥物以及5%CDT-FBS、1%青-鏈霉素雙抗的無酚紅DMEM高糖培養液150 μL。分別于培養24、48、72 h時，各孔加入CCK-8試劑15 μL，于37 ℃孵育2 h，使用熒光/吸收光酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的吸光度（A），計算細胞增殖率：增殖率（%）=（試驗組平均A值/空白組平均A值）×100%。上述試驗重復3次。

2.3 細胞中ER-α、ER-β蛋白表達情況檢測

采用Western blotting法檢測。取“2.1”項下經培養且處于對數生長期的細胞適量，用PBS清洗2次，經0.25%胰蛋白酶消化后，以不含血清的DMEM高糖培養液調整細胞密度，并按1×106個/孔接種于6孔板中，每孔總體積為2 mL。培養24 h待細胞貼壁后，將其隨機分為空白組、β-E2組（1×10-8 mol/L）和TSG低、中、高濃度組（濃度參考“2.2”項下試驗結果設置），每組設4個復孔。吸棄上清液，空白組加入含5%CDT-FBS、1%青-鏈霉素雙抗的無酚紅DMEM高糖培養液2 mL，各給藥組加入含相應藥物以及5%CDT-FBS、1%青-鏈霉素雙抗的無酚紅DMEM高糖培養液2 mL。培養48 h后，收集細胞，經細胞裂解液裂解后，以12 000 r/min離心15 min，取上清液按BCA法測定蛋白濃度。將蛋白于100 ℃變性5 min后，取20 μg行SDS-PAGE。電泳后轉移至PVDF膜上，室溫封閉15 min，加入ER-α、ER-β和β-actin一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜;用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液清洗10 min×3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 10 000），室溫孵育1 h;用TBST溶液清洗10 min×3次，經ECL顯色后，于超高靈敏化學發光成像系統上成像。使用Image-Pro Express 5.1軟件分析，以相應蛋白與內參β-actin條帶的灰度值比值作為目標蛋白的表達量。上述試驗重復3次。

2.4 細胞中ER-α、ER-β mRNA表達情況檢測

采用RT-PCR法檢測。取“2.1”項下經培養且處于對數生長期的細胞，按“2.3”項下方法培養、分組、給藥，每組設3個復孔。培養48 h后，收集細胞，參照TRNzol Universal總RNA提取試劑說明書方法提取總RNA，使用超微量分光光度計測定其純度（即A260 nm/A280 nm值，若該值為1.8～2.0即表明其純度符合試驗要求[10]）。參照FastKing一步法RT-PCR試劑盒說明書方法進行RT-PCR。反應體系（50 μL）：總RNA 2 μL，2×FastKing One Step RT-PCR Master Mix 25 μL，25×RT-PCR Enzyme Mix 2 μL，上/下游引物各1.25 μL、無RNA酶的ddH2O 18.5 μL。反應條件：40 ℃逆轉錄30 min;95 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環35次;72 ℃再延伸5 min。擴增產物行1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，于超高靈敏化學發光成像系統上成像。使用Image Lab 5.2.1軟件分析，以相應基因與內參β-actin條帶的灰度值比值作為目標基因mRNA的表達量。上述試驗重復3次。

2.5 統計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 TSG對T-47D細胞增殖的影響

與空白組比較，β-E2組和TSG各濃度組各時間點（除β-E2組48 h外）的細胞增殖率均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且用藥72 h時TSG 1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L組的細胞增殖率均顯著高于β-E2組（P<0.05），詳見表2。根據上述結果，本研究以1×10-8、1×10-6、1×10-4 mol/L作為TSG的低、中、高濃度進行后續試驗。

3.2 TSG對T-47D細胞中ER-α、ER-β蛋白表達的影響

與空白組比較，各給藥組細胞中ER-α、ER-β蛋白的表達量均顯著升高，且TSG低濃度組ER-β蛋白的表達量顯著高于β-E2組（P<0.05或P<0.01）。其中，β-E2組細胞中ER-α、ER-β蛋白的表達量分別增加了56%、29%，TSG低、中、高濃度組細胞中上述蛋白的表達量分別增加了61%、69%、30%（ER-α）和83%、28%、34%（ER-β），詳見圖1、表3。

3.3 TSG對T-47D細胞中ER-α、ER-β mRNA表達的影響

與空白組比較，各給藥組細胞中ER-α、ER-β mRNA的表達量均顯著升高，且TSG各濃度組ER-α mRNA以及TSG低、高濃度組ER-β mRNA的表達量均顯著高于β-E2組（P<0.05或P<0.01）。其中，β-E2組細胞中ER-α、ER-β mRNA的表達量分別增加了22%、27%，TSG低、中、高濃度組細胞中上述mRNA的表達量分別增加了52%、127%、41%（ER-α）和95%、26%、131%（ER-β），詳見圖2、表3。

4 討論

雌激素是女性體內重要的性激素，不僅能促進女性生殖器官發育、維持第二性征，而且在骨代謝、心血管活動和神經功能中也具有重要作用[11]。雌激素水平低下可引發一系列疾病，如骨質疏松、更年期綜合征、心血管疾病等，嚴重影響了女性的正常生活;同時，長期應用雌激素替代療法的副作用較多，且可增加雌激素依賴性腫瘤（如乳腺癌、子宮內膜癌等）發生的風險[11]。因此，不良反應少的植物雌激素逐漸受到學者的關注，現已成為相關研究的熱點之一[12]。

植物雌激素可與ER結合而發揮雌激素樣作用，在調節ER表達水平的同時，亦可用于治療骨質疏松、圍絕經期綜合征、心血管疾病、肥胖等癥[12-13]。ER主要包括ER-α和ER-β，其中ER-α的親和力及總體活性更高[14]。TSG是中藥制首烏的主要活性成分，前期研究表明其在體內具有一定的植物雌激素作用。為進一步探討該化合物雌激素樣活性及作用機制，本課題組以ER（+）T47-D細胞（該細胞含有豐富的ER，易受雌激素或雌激素樣物質誘導而增殖，是用于檢測化合物雌激素樣活性的常用細胞株[15]）為對象，以β-E2為陽性對照，通過體外試驗初步考察了不同濃度TSG對細胞增殖和ER表達影響。

CCK-8試驗結果顯示，各給藥組各時間點（除β-E2組48 h外）的細胞增殖率均較空白組顯著升高，且用藥72 h時TSG 1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L組的細胞增殖率均顯著高于β-E2組。這提示陽性對照藥和TSG均具有促進T-47D細胞增殖的作用，且TSG（1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L）的作用持續時間可能較陽性對照藥更長。在本研究過程中發現，TSG各濃度組細胞的增殖率均有先升高后降低的趨勢，且在濃度為1×10-6 mol/L（24、72 h）時達到峰值;同時，TSG在1×10-8～1×10-4 mol/L的濃度范圍內均可顯著促進T-47D細胞的增殖，故本研究最終選擇了1×10-8、1×10-6、1×10-4 mol/L作為TSG后續試驗中的低、中、高濃度。

本研究進一步采用Western blotting法和RT-PCR法分別測定了各組細胞中ER-α蛋白及其mRNA的表達情況。結果顯示，各給藥組細胞中ER-α蛋白及其mRNA的表達量均較空白組顯著升高，且TSG各濃度組ER-α mRNA的表達量均顯著高于β-E2組。這提示陽性對照藥和TSG均可不同程度地上調ER-α蛋白及其mRNA的表達。值得注意的是，TSG各濃度組細胞ER-α蛋白表達量與β-E2組無明顯差異，但其mRNA的表達量卻顯著升高，這可能與設計ER-α mRNA擴增引物時未包含變異片段，而β-E2可誘導引物外某些序列片段轉錄有關[16]。此外筆者還發現，在TSG 1×10-8～1×10-4 mol/L的濃度作用范圍內，細胞中ER-α蛋白及其mRNA的表達呈先上升后下降的趨勢，在TSG 1×10-6 mol/L（中劑量）時其增強上述指標表達的效果最明顯，這可能與PE的雙重調節作用有關，即低濃度協同、高濃度拮抗的擬/抗雌激素作用[17]。

本研究同法測定了各組細胞中ER-β蛋白及其mRNA的表達情況。結果顯示，各給藥組細胞中ER-β蛋白及其mRNA的表達量均較空白組顯著升高，且TSG低濃度組ER-β蛋白表達量以及TSG低、高濃度組ER-β mRNA的表達量均顯著高于β-E2組。這提示陽性對照藥和TSG均可不同程度地上調ER-β蛋白及其mRNA的表達，且TSG低濃度的誘導作用普遍強于陽性對照藥。值得注意的是，雖然高濃度TSG也可顯著上調ER-β mRNA的表達，但其對蛋白的上調作用相對較弱，這可能是因為蛋白表達除受mRNA降解的影響外，可能還受蛋白自組裝的影響，從而導致mRNA轉錄水平和蛋白翻譯水平不同步[18-19]。此外筆者還發現，在TSG 1×10-8～1×10-4 mol/L的作用濃度范圍內，細胞中ER-β蛋白呈先下降后升高的趨勢，在TSG 1×10-8 mol/L（低劑量）時其增強上述指標表達的效果最明顯。ER-β與ER-α變化趨勢不同，這可能與兩種亞型活性不同、應答不同有關[12]。

有文獻指出，植物雌激素的活性較雌激素弱[12]，且本課題組前期研究也得出了類似結論[6]。但本研究結果卻提示，TSG的雌激素樣活性與β-E2無明顯差異，甚至在某些濃度下還強于β-E2。筆者分析其原因，認為：其一，β-E2多以DMSO為溶劑，若DMSO體積分數超過0.2%則會產生細胞毒性[20];其二，受試物TSG是單一化學成分，而本課題組前期研究以制首烏為對象，成分復雜，故作用強弱有所差異。

綜上所述，制首烏活性成分TSG可誘導T-47D細胞的體外增殖，并可通過促進ER蛋白及mRNA的表達來發揮雌激素樣作用。本課題組將在此研究的基礎上，進一步探討TSG對雌激素依賴性腫瘤細胞的影響，挖掘其雌激素樣作用的具體機制，以期為制首烏藥材及其活性成分的雌激素樣作用的物質基礎研究以及臨床應用提供更多的實驗依據。

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