“汗?jié)n法”炮制對(duì)了哥王中芫花素含量及其抗氧化能力的影響

周志容 馮果 李瑋 鄭傳奇 許琴 任晨晨 彭禮珍 黃僑宗 肖曉燕

摘 要 目的：比較“汗?jié)n法”炮制前后了哥王乙醇提取物中活性/毒性成分芫花素的含量變化，以及炮制對(duì)其抗氧化能力的影響。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定“汗?jié)n法”炮制前后了哥王藥材中芫花素的含量。色譜柱為Diamonsil C18，流動(dòng)相為0.2%磷酸水溶液-甲醇（梯度洗脫），流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為346 nm，進(jìn)樣量為20 ?L。將SD大鼠隨機(jī)分為空白組、了哥王生品乙醇提取物組（317.52 mg/kg，簡(jiǎn)稱(chēng)“生品組”）和了哥王炮制品乙醇提取物組（317.52 mg/kg，簡(jiǎn)稱(chēng)“炮制品組”），每組6只。空白組大鼠灌胃等體積1.0%羧甲基纖維素鈉溶液，各給藥組灌胃相應(yīng)藥物混懸液，灌胃體積均為20 mL/kg，每日1次，連續(xù)14 d。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)[丙二醛（MDA）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）]的含量。結(jié)果：芫花素進(jìn)樣檢測(cè)量的線性范圍為0.147～27.360 μg（r=0.999 9）;精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均小于3%;平均加樣回收率為98.64%～98.92%（RSD<1%，n=3）。“汗?jié)n法”炮制前后，了哥王藥材中芫花素的平均含量分別為0.377 6、0.234 0 mg/g。與空白組比較，生品組大鼠血清中SOD含量顯著升高，CAT含量顯著降低（P<0.05或P<0.01）;炮制品組大鼠血清中MDA含量顯著降低，SOD含量顯著升高（P<0.05或P<0.01）;且炮制品組MDA含量顯著低于生品組，SOD含量顯著高于生品組（P<0.05）。結(jié)論：經(jīng)“汗?jié)n法”炮制后，了哥王藥材中芫花素的含量有所降低，且抗氧化活性增強(qiáng);“汗?jié)n法”具有一定的“減毒增效”效果。

關(guān)鍵詞 了哥王;汗?jié)n法;芫花素;含量;抗氧化能力;減毒增效

ABSTRACT?OBJECTIVE： To compare the content changes of active/toxic ingredient genkwanin in ethanol extract from Wikstroemia indica before and after processing with “sweat soaking method” and the effects of processing method on its anti-oxidation ability. METHODS： HPLC method was adopted to determine the content of genkwanin in W. indica before and after processing with “sweat soaking method”. The separation was performed on Diamonsil C18 column with 0.2% phosphoric acid solution-methanol as mobile phase （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The column temperature was 30 ℃ and detection wavelength was set at 346 nm. The sample size was 20 ?L. SD rats were randomly divided into blank group， W. indica raw product ethanol extract group （317.52 mg/kg， called “raw-product group” as short） and W. indica processed product ethanol extract group （317.52 mg/kg， called “processed-product group” as short）， with 6 rats in each group. Blank group was given constant volume of 1.0%CMC-Na solution intragastrically， and administration groups were given relevant medicine suspension intragastrically; all of them were given 20 mL/kg， once a day， for consecutive 14 days. The contents of serum oxidant stress indexes （MDA， CAT， SOD） in rats were determined by ELISA. RESULTS： The linear range of genkwanin were 0.147-27.360 μg （r=0.999 9）; RSDs of precision， reproducibility and stability tests were all lower than 3%; average recoveries were 98.64%-98.92%（RSD<1%， n=3）. Before and after processing with “sweat soaking method”， average contents of genkwanin in W. indica were 0.377 6 and 0.234 0 mg/g. Compared with blank group， the serum content of SOD in raw-product group was increased significantly， while CAT content was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）; the serum content of MDA was decreased significantly in processed-product group， while SOD content was increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. MDA content of processed-product group was significantly lower than that of raw-product group， while SOD content was significantly higher than raw-product group （P<0.05）. CONCLUSIONS： After processing with “sweat soaking method”， the content of genkwanin in W. indica is decreased， and antioxidant activity is increased. “Sweat soaking method” processes certain function of “reducing toxicity and increasing efficiency”.

KEYWORDS ? Wikstroemia indica; Sweat soaking method; Genkwanin; Content; Anti-oxidation ability; Reducing toxicity and increasing efficiency

了哥王Wikstroemia indica （L.） C. A. Mey為瑞香科蕘花屬植物南嶺蕘花的干燥根或根皮，始載于《嶺南采藥錄》，性寒，味苦、辛，有大毒，歸肺、肝經(jīng)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、止痛等功效[1-2]，臨床上主要用于治療肝炎、支氣管炎、扁桃體炎、肢體疼痛等，同時(shí)還可用于治療肝癌、乳腺癌、肺癌及其他體表癌等[3-6]。目前，從了哥王中分離得到的化合物主要包括香豆素類(lèi)[7-8]、木脂素類(lèi)[9]、黃酮類(lèi)[5，10-11]、蒽醌類(lèi)[12]、萜類(lèi)等;其中，芫花素屬于黃酮類(lèi)化合物，具有一定的抗氧化作用[13]。細(xì)胞試驗(yàn)初步證實(shí)，了哥王也具有抗氧化活性[14]，芫花素可能是其抗氧化活性成分之一。然而，芫花素也是該藥的毒性成分之一，存在于了哥王毒性部位乙酸乙酯部位[15]，有研究表明該化合物具有可遺傳毒性[16-18]。苗族群眾通常采用“汗?jié)n法”炮制了哥王以降低其毒性。本課題組前期對(duì)“汗?jié)n法”進(jìn)行了深入研究，優(yōu)選出最佳炮制工藝[19];同時(shí)，對(duì)了哥王炮制前后的毒理學(xué)[20-21]和抗炎作用[3]進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)“汗?jié)n法”具有“減毒增效”作用。考慮到芫花素既是了哥王的毒性成分又是活性成分，含有芫花素的毒性中藥大多采用醋制法炮制以降低該成分含量[22]，而關(guān)于“汗?jié)n法”炮制對(duì)了哥王藥材中芫花素含量的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。基于此，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定“汗?jié)n法”炮制前后了哥王乙醇提取物中芫花素的含量，并進(jìn)行抗氧化作用比較，擬基于“量-效-毒”關(guān)系進(jìn)一步考察“汗?jié)n法”炮制的“減毒增效”作用，為了哥王的炮制方法、質(zhì)量控制研究和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 Infinity Ⅱ型液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）;AUW220D型電子天平（日本Shimadzu公司）;800Y型粉碎機(jī)（浙江大鵬機(jī)械有限公司）;自動(dòng)滲漏管（180 mm×1 000 mm，北京儀器廠）;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;DZF-6020型減壓真干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;C21-SDHCB47型電磁爐（浙江蘇泊爾股份有限公司）;HH-S4型水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）;Thermo Multiskan FC型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;MIKRO 220R型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）;VX-Ⅲ型多管渦旋振蕩器（北京踏錦科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

了哥王藥材（產(chǎn)地：廣西玉林，批號(hào)：20160115）購(gòu)自廣西壯族自治區(qū)玉林市玉林銀豐國(guó)際中藥港，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李瑋教授鑒定為瑞香科蕘花屬植物南嶺蕘花W. indica（L.）C. A. Mey.的根或根皮。

芫花素對(duì)照品（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司，批號(hào)：111899-201202，純度：≥98.0%）;丙二醛（MDA）試劑盒（批號(hào)：20160515）、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒（批號(hào)：20160515）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號(hào)：20160515）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;戊巴比妥鈉（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：922L0310）;甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20） g，購(gòu)自湖南長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2014-0011。所有大鼠均飼養(yǎng)于12 h光照、12 h避光交替，室內(nèi)溫度（25±1） ℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中，并給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 了哥王生品及“汗?jié)n法”炮制品乙醇提取物的制備

參照本課題組前期研究方法[23]制備了哥王生品和“汗?jié)n法”炮制品（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“炮制品”）的乙醇提取物（批號(hào)分別為YC20180420、PZ20180430），每100 g醇提物均相當(dāng)于生藥992 g。

2.2 “汗?jié)n法”炮制前后了哥王中芫花素的含量變化

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取芫花素對(duì)照品18.4 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.368 mg/mL的對(duì)照品溶液，于4 ℃下保存，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 分別稱(chēng)取了哥王生品乙醇提取物和炮制品乙醇提取物適量，粉碎，取粉末各0.5 g，置于具塞三角燒瓶中，加80%甲醇30 mL，稱(chēng)定質(zhì)量;密塞，超聲（功率：150 W，頻率：40 kHz）提取30 min，冷卻至室溫，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用80%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò);濾液蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，繼續(xù)加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。分析前，將供試品溶液用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液進(jìn)樣分析。

2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：0.2%磷酸水溶液（A）-甲醇（B）（梯度洗脫：0～5 min，65%B→70%B;5～8 min，70%B→75%B;8～15 min，75%B→78%B;15～20 min，78%B→80%B）;柱溫：30 ℃;流速：1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：346 nm;進(jìn)樣量：20 ?L。

分別取空白對(duì)照溶液（以流動(dòng)相A、B體積比3 ∶ 7配制）、芫花素對(duì)照品溶液、供試品溶液各適量，按上述色譜進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，在該色譜條件下，芫花素能與其他成分達(dá)到較好的分離，分離度大于1.5;理論板數(shù)按芫花素峰計(jì)不低于3 000。

2.2.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2、0.5、1、3、5、7、10 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL，按“2.2.3”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測(cè)成分的進(jìn)樣量（x， ?μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=2 280.3x-5.984 6（r=999 9）。結(jié)果表明，芫花素檢測(cè)進(jìn)樣量的線性范圍為0.147 2～7.360 μg。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度為2.208 μg/mL的芫花素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，芫花素峰面積的RSD為2.34%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取了哥王生品乙醇提取物0.5 g，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量。結(jié)果，芫花素平均含量為0.375 9 mg/g（RSD=1.12%，n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下了哥王生品乙醇提取物供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24、48 h時(shí)按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果，芫花素峰面積的RSD為1.61%（n=7），表明供試品溶液室溫放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的了哥王生品乙醇提取物0.25 g，共9份，精密稱(chēng)定;分別按已有含量的80%、100%、120%加入芫花素對(duì)照品溶液各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，平均加樣回收率為98.64%～98.92%，RSD均小于1%，表明方法準(zhǔn)確度良好，詳見(jiàn)表1。

2.2.9 樣品含量測(cè)定 取了哥王生品和炮制品的乙醇提取物各適量，平行6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 “汗?jié)n法”炮制前后了哥王抗氧化能力比較

2.3.1 藥液的配制 分別精密稱(chēng)取了哥王生品和炮制品的乙醇提取物0.794 g，加1.0%羧甲基纖維素鈉（CMC- Na）溶液稀釋?zhuān)渲瞥?0 mL的提取物混懸液，備用。

2.3.2 劑量設(shè)置 了哥王日服劑量為生藥量10～15 g[24]，以其提取物半數(shù)致死量（LD50）[20]折算成生藥量為46.678 g（按日用劑量15.0 g計(jì)算，相當(dāng)于日用劑量的3倍）。綜合考慮，本研究擬采用2倍日用劑量進(jìn)行干預(yù)，并根據(jù)了哥王的提取率（10.08%）[23]以及臨床劑量折算方法[25]，計(jì)算得大鼠灌胃劑量約為317.5 mg/kg（以提取物質(zhì)量計(jì)，下同）。本課題組前期研究結(jié)果表明，在此劑量下了哥王無(wú)毒副作用且藥效穩(wěn)定[23]。

2.3.3 分組與給藥 所有大鼠均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組：了哥王生品乙醇提取物組（生品組）、了哥王炮制品乙醇提取物組（炮制品組）和空白組，每組6只。空白組大鼠灌胃等體積1.0%CMC-Na溶液，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)提取物混懸液（317.52 mg/kg），灌胃體積均為20 mL/kg，每日1次，連續(xù)14 d。在此期間，所有大鼠均正常飲食、飲水。

2.3.4 抗氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后，禁食不禁水12 h，次日（第15天），大鼠腹腔注射3.0%戊巴比妥鈉溶液（0.2 mL/100 g）麻醉后，于腹主動(dòng)脈取血。血樣在室溫下靜置40 min后，以12 000 r/min離心15 min，分離血清，于-20 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)大鼠血清中MDA、CAT、SOD的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。采用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果顯示，與空白組比較，生品組大鼠血清中SOD含量顯著上升、CAT含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），而MDA含量雖有所降低，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;炮制品組大鼠血清MDA含量顯著降低、SOD含量顯著升高（P<0.05或P<0.01），而CAT含量雖有所升高，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與生品組比較，炮制品組大鼠血清中MDA含量顯著降低、SOD含量顯著升高（P<0.05），而CAT含量雖有所升高，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見(jiàn)表3。

3 討論

毒性中藥炮制是炮制研究領(lǐng)域的重點(diǎn)，也是難點(diǎn)之一，其目的在于減輕或消除藥材的毒副作用、提高其療效[26]。“汗?jié)n法”又稱(chēng)“身背汗?jié)穹ā保瑸槊缱宓貐^(qū)的一種特殊炮制法，其具體操作是將藥材捆扎于人體腰部，通過(guò)人體產(chǎn)生的汗液和體溫，以汗液浸漬的方式對(duì)藥材進(jìn)行炮制，從而降低其毒性。本課題組在保持民族特色的基礎(chǔ)上，模仿人體條件，以人工汗液為輔料炮制了哥王，并優(yōu)選出具有“減毒增效”的人工“汗?jié)n法”[20]。與民間傳統(tǒng)方法相比，該法更加簡(jiǎn)便、科學(xué)且適用于了哥王藥材大批量、規(guī)范化、規(guī)模化炮制。

了哥王中含有豐富的黃酮類(lèi)化合物。鑒于芫花素既是該藥材中的抗氧化有效成分，同時(shí)又是毒性成分之一，故本研究以此成分為對(duì)象，對(duì)炮制前后芫花素的含量和藥材的抗氧化活性進(jìn)行了比較，擬進(jìn)一步探討炮制前后了哥王藥材毒性與藥效之間的關(guān)系。

首先，本研究采用HPLC法測(cè)定了了哥王藥材中芫花素的含量。在前期研究中，本課題組分別選擇甲醇、乙腈作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)以甲醇洗脫時(shí)，芫花素峰形較好、分離度高，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為流動(dòng)相的有機(jī)相。定量分析結(jié)果顯示，了哥王生品中芫花素的平均含量為0.377 6 mg/g;經(jīng)“汗?jié)n法”炮制后，炮制品中芫花素的平均含量降至0.234 0 mg/g，提示炮制可降低毒性成分的含量。但其是否與“汗?jié)n法”的“減毒增效”作用有關(guān)，還有待后續(xù)研究進(jìn)一步探討。

作為幾乎所有真核生命體中不可或缺的抗氧化酶，SOD能清除生物新陳代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的超氧陰離子自由基并減少和阻止脂質(zhì)的過(guò)氧化反應(yīng)，因此其是反映機(jī)體抗氧化能力和清除自由基能力的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[27]。CAT能清除體內(nèi)的過(guò)氧化氫，還可以氧化甲醛、苯酚等毒性物質(zhì)以保護(hù)組織和細(xì)胞免受氧化損傷，是機(jī)體氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一[28]。自由基與不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)生成MDA，后者能與膜蛋白的游離氨基發(fā)生交聯(lián)，同時(shí)可以破壞膜結(jié)構(gòu)和膜蛋白功能，故MDA的含量可以反映機(jī)體過(guò)氧化的嚴(yán)重程度以及機(jī)體清除自由基的能力[29-30]。有鑒于此，本研究通過(guò)檢測(cè)大鼠血清中SOD、CAT、MDA含量的變化來(lái)初步評(píng)價(jià)了哥王生品和炮制品的抗氧化活性。結(jié)果顯示，了哥王生品和炮制品的乙醇提取物均可降低大鼠血清MDA含量，但生品提取物對(duì)該指標(biāo)的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;兩者對(duì)大鼠血清SOD含量均有顯著的提升作用，且炮制品提取物對(duì)MDA、SOD的調(diào)節(jié)作用強(qiáng)于生品提取物。了哥王生品乙醇提取物對(duì)大鼠血清CAT含量具有顯著的下調(diào)作用，而炮制品乙醇提取物對(duì)該指標(biāo)的上調(diào)作用輕微。以上結(jié)果表明，了哥王生品和炮制品的乙醇提取物均具有增加抗氧化物質(zhì)SOD含量的作用;炮制品提取物可抑制MDA的表達(dá)，而生品提取物對(duì)MDA的影響不明顯;生品提取物可顯著降低CAT的含量，而炮制品提取物對(duì)CAT的影響不明顯。這可能與“汗?jié)n法”炮制有關(guān)：結(jié)合前文含量測(cè)定結(jié)果，炮制品中芫花素的含量有所降低，而抗氧化活性增強(qiáng)且對(duì)SOD、MDA、CAT的影響有所不同，筆者認(rèn)為這可能與“汗?jié)n法”炮制使得了哥王藥材活性成分發(fā)生了改變，從而影響了其在機(jī)體內(nèi)的代謝過(guò)程有關(guān)。但芫花素含量變化與了哥王抗氧化活性改變的具體關(guān)聯(lián)及機(jī)制還有待進(jìn)一步確證。

綜上所述，本研究進(jìn)一步完善了“汗?jié)n法”炮制了哥王的“減毒增效”研究，為民間炮制方法“汗?jié)n法”炮制藥材提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但由于了哥王炮制前后化學(xué)成分變化復(fù)雜，其“減毒增效”的具體機(jī)制尚不明確，且對(duì)炮制前后藥材中化學(xué)成分的變化，特別是主要毒性成分的研究還不夠深入，對(duì)內(nèi)源性代謝物及相關(guān)代謝通路的干擾也有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2020-04-06 修回日期：2020-07-01）

（編輯：張?jiān)拢?/p>