基于Met/PI3K/Akt信號通路研究五味子甲素對人鼻咽癌細胞HONE-1增殖、遷移和侵襲的影響

陳騰祥 梁黎 曾智銳 雷珊 王婧雅 孫遠梅 蘭金芝 薛燕

摘 要 目的：研究五味子甲素對人鼻咽癌細胞HONE-1增殖、遷移和侵襲的影響及其可能機制。方法：以HONE-1細胞為研究模型，使用不同濃度[0（空白對照）、10、20、40 μmol/L]的五味子甲素處理后，分別采用CCK-8試驗、劃痕試驗和Transwell小室試驗檢測細胞的增殖、遷移和侵襲能力變化;通過計算機分子對接分析五味子甲素與酪氨酸蛋白激酶（Met）蛋白的結合能力;采用Western blotting法檢測細胞中磷酸化酪氨酸蛋白激酶（p-Met）、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）的相對表達量。結果：與空白對照比較，10、20、40 μmol/L五味子甲素處理后細胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著減弱（P<0.05）;分子對接結果顯示，五味子甲素能與Met蛋白的活性口袋穩定結合;Western blotting試驗結果顯示，與空白對照比較，10、20、40 μmol/L五味子甲素處理后細胞中p-Met、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2和N-cadherin蛋白的相對表達量均顯著降低（P<0.05）。結論：五味子甲素可通過抑制Met/PI3K/Akt信號通路的活化來抑制HONE-1細胞的增殖、遷移和侵襲。

關鍵詞 五味子甲素;增殖;遷移;侵襲;酪氨酸蛋白激酶;磷脂酰肌醇-3-激酸;蛋白激酶B;人鼻咽癌細胞HONE-1

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the effects and potential mechanism of deoxyschizandrin on the proliferation， migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cell HONE-1. METHODS： HONE-1 cell was set as cell model， while CCK-8 test， wound healing assay and Transwell chamber test were used to detect the proliferation， migration and invasion ability changes of HONE-1 cells after treatment with different concentrations [0 （blank control）， 10， 20， 40 μmol/L] of deoxyschizandrin. Computer molecular docking was performed to analyze the binding ability between deoxyschizandrin and Met protein. Western blotting assay was used to detect the relative protein expressions of p-Met， p-PI3K， p-Akt， Bcl-2 and N-cadherin in cells. RESULTS： Compared with blank control， the proliferation， migration and invasion ability of cells after treated with 10， 20， 40 μmol/L deoxyschizandrin were all decreased significantly （P<0.05）. Results of molecular docking revealed that deoxyschizandrin could stably bind with the activity pocket of Met protein. Results of Western blotting assay demonstrated that compared with blank control， 10， 20， 40 ? ? ?μmol/L deoxyschizandrin all decreased the relative protein ?expressions of p-Met， p-PI3K， p-Akt， Bcl-2 and N-cadherin in cells significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： Deoxyschizandrin can inhibit the proliferation， migration and invasion of HONE-1 cell via inhibiting the activation of Met/PI3K/Akt signaling pathway.

KEYWORDS ? Deoxyschizandrin; Proliferation; Migration; Invasion; Met;PI3K;Akt;Human nasopharyngeal carcinoma cell HONE-1

鼻咽癌（Nasopharyngeal cancer）是一種在我國南部地區高發的頭頸部惡性腫瘤，在廣東省的發病率很高，故也被稱為“廣東癌”。目前，針對鼻咽癌的主要治療手段為放療，但放療后患者的總生存率仍低于50%，且大部分患者在治療后3～5年內會出現復發、化療耐受等情況[1-2]，因此迫切需要挖掘新的治療鼻咽癌的藥物。

酪氨酸蛋白激酶（Met）也稱為c-Met，是一種受體酪氨酸激酶，在上皮細胞中廣泛表達。在生理作用下，Met通過調控多個酪氨酸激酶[如磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）和Rac家族GTP酶 1（RAC-1）]的磷酸化，進而調節細胞的增殖、遷移和分化等各項生物學功能[3]。在鼻咽癌患者中，Met表達升高，且與患者的不良預后相關[4]。此外，PI3K/蛋白激酶B （Akt）信號通路在鼻咽癌中呈異常活化，可通過調控B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）等增殖相關因子和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）等遷移相關因子的表達，促進鼻咽癌的進展;而Met可以通過促進PI3K的磷酸化從而激活PI3K/Akt信號通路[5-6]。多項研究表明，通過基因工程或藥理學手段抑制Met的表達或活性，能夠抑制鼻咽癌細胞的增殖和轉移。例如人工合成的Met抑制劑PF-2341066能夠顯著抑制鼻咽癌細胞的增殖，并與常規化療藥物順鉑有協同作用[7];再如利用慢病毒過表達miR-34c抑制Met的表達，能夠抑制鼻咽癌的侵襲性[8]。

中藥是我國重要的資源寶庫，五味子甲素是中藥五味子中的有效成分之一。本課題組早期研究發現，五味子甲素能夠抑制多種腫瘤細胞（如肝癌和胰腺癌細胞等）的增殖和遷移[9-10]。然而，五味子甲素對鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機制仍不清楚。因此，本研究旨在探討五味子甲素對人鼻咽癌細胞HONE-1增殖、遷移和侵襲的影響以及其分子機制，為臨床治療鼻咽癌提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

SW-CJ-1F（D）型單人工作臺（蘇州蘇凈安泰生物公司）;BPN-80RNP型二氧化碳培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）;Multiskan GO型多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）;SZX16型倒置光學顯微鏡（日本Olympus公司）;DYCZ-24K型電泳儀、DYCZ-40D型轉膜儀（北京六一生物科技有限公司）;GelDoc XR+型凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

五味子甲素對照品（美國Med Chem Express公司，批號：HY-N0693，純度：>98%）;DMEM高糖細胞培養基、胎牛血清（FBS）（美國Gibco公司，批號：8120103、SA211.02）;0.25%胰蛋白酶溶液（美國Multicell公司，批號：325043032）;CCK-8試劑（武漢博士德生物工程有限公司，批號：15E27C60）;Transwell小室（美國Corning公司，批號：30419069）;Matrigel膠（美國BD公司，批號：354263）;RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF（武漢賽維爾生物技術有限公司，批號：G2002-100、G2008-01D）;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）定量試劑盒（大連美侖生物技術有限公司，批號：MA0388-08F、MA0082-02C）;兔源Met多克隆抗體、鼠源PI3K單克隆抗體、兔源Akt多克隆抗體、兔源Bcl-2多克隆抗體、兔源N-cadherin多克隆抗體、鼠源β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（武漢三鷹生物技術公司，批號：25869、60225、10176、12789、22018、60008）;兔源磷酸化PI3K（p-PI3K）多克隆抗體、兔源磷酸化Akt（p-Akt）多克隆抗體（美國CST公司，批號：17366、4060）;辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗、HRP標記的山羊抗鼠二抗（武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號：AS014、AS003）;ECL高敏曝光液（武漢聚能慧達生物有限公司，批號：36222ES60）;二甲基亞砜（DMSO）等其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為雙蒸水。

1.3 細胞

人鼻咽癌細胞HONE-1由貴州省腫瘤醫院腫瘤科饋贈。

2 方法

2.1 細胞培養

將HONE-1細胞用含10%FBS的DMEM高糖培養基在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養，當細胞生長融合達85%時，用0.25%胰蛋白酶溶液進行消化、傳代，取對數生長期細胞用于后續研究。

2.2 CCK-8試驗檢測五味子甲醇對細胞增殖能力的影響

將細胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化后，以1 000 ? ? ?r/min離心5 min，收集細胞，用含10%FBS的DMEM高糖培養基重懸，制備成密度為2×104個/mL的細胞懸液，按100 μL/孔接種至96孔板。將細胞分為空白對照組（含0.4%DMSO）和五味子甲素不同濃度組（10、20、40 ? ?μmol/L，含4%DMSO），每組設置6個復孔。同時設置不加細胞和藥物的調零孔。將各組細胞置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養過夜，然后加入相應藥物，繼續培養24、48 h。吸棄培養基，按100 μL/孔的量加入CCK-8溶液（將CCK-8試劑與DMEM高糖培養基以體積比1 ∶ 9混合），繼續培養2 h后，采用多功能酶標儀在450 nm波長處測量每孔的吸光度（OD）值，并計算各組細胞的相對增殖率[細胞相對增殖率（%）=（五味子甲素給藥組OD值-調零孔OD值）/（空白對照組OD值-調零孔OD值）×100%]。試驗重復3次。

2.3 細胞劃痕試驗檢測細胞遷移能力

將細胞按“2.2”項下方法消化、離心、收集并重懸，制備成密度為1×105個/mL的細胞懸液，按2 mL/孔的量接種至6孔板。將細胞分為空白對照組（含0.4%DMSO）和不同濃度五味子甲素組（10、20、40 μmol/L，含0.4%DMSO），每組設置3個復孔。將細胞置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養，待細胞生長融合達95%以上時，用200 μL移液槍頭在每個孔中的單層細胞上劃線，然后以PBS洗滌2次后，各孔加入相應藥物，繼續培養0、24 h后，于倒置顯微鏡下觀察。隨機選取5個視野進行拍照，使用Image Pro Plus 6.0軟件測量劃痕面積，并根據0 h與24 h時的劃痕面積差值計算細胞的遷移率[遷移率（%）=（給藥0 h時的劃痕面積-給藥24 h時的劃痕面積）/給藥0 h時的劃痕面積×100%]。試驗重復3次。

2.4 Transwell小室試驗檢測細胞侵襲能力

將Matrigel膠和無血清DMEM高糖培養基按1 ∶ 8的體積比混勻，鋪于Transwell上室，并置于37 ℃培養箱中烘干，棄掉多余的培養基。將細胞按“2.2”項下方法消化、離心、收集并重懸，制備成密度為2×105個/mL的細胞懸液，用移液槍分別吸取200 μL加入到Transwell上室，再分別加入0（空白對照）、10、20、40 μmol/L的五味子甲素（均含0.4%DMSO），每個濃度設置3個樣本。在下室中加入700 μL含10%FBS的DMEM高糖培養基。培養24 h后，使用4%多聚甲醛固定小室，用PBS漂洗2次，然后用0.1%結晶紫染色15 min。擦拭掉非侵襲細胞后，在倒置顯微鏡下觀察，計數每孔轉移至微孔膜下層的細胞數，每個樣本隨機選擇5個視野進行計數。試驗重復3次。

2.5 計算機分子對接分析五味子甲素與Met蛋白的結合能力

從在線數據庫PubChem Compound（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/）中下載五味子甲素的三維結構文件（SDF格式）。從在線數據庫Protein Data Bank（PDB，https：//www.rcsb.org/）中下載Met蛋白的晶體結構文件（該蛋白在PDB數據庫的檢索ID號：3DKF）。將Met蛋白的晶體結構文件導入到SYBYL 1.3軟件中，刪除原配體、修復氨基端和羧基端的黏性末端后，以自動識別模式根據蛋白序列鑒定蛋白的活性口袋;再導入五味子甲素的三維結構文件，以柔性對接模式進行對接。根據結合評分（C-score：0～5）判斷分子與蛋白活性口袋結合的穩定性，C-score在4～5分范圍則可認為分子與蛋白能夠穩定結合[11]。

2.6 Western blotting法檢測細胞中Met/PI3K/Akt信號通路相關蛋白的表達情況

將細胞按“2.2”項下方法消化、離心、收集并重懸，制備成密度為1×105個/mL的細胞懸液，按2 mL/孔接種至6孔板。將細胞置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養，待細胞貼壁后，分別加入0（空白對照）、10、20、40 μmol/L的五味子甲素（均含0.4%DMSO）培養24 h。培養結束后，吸棄培養基，加入RIPA裂解液和PMSF蛋白酶抑制劑混合液（體積比為100 ∶ 1），在冰上裂解細胞15 min，然后在4 ℃下以12 000 r/min離心30 min，吸取蛋白上清液，用BCA法進行蛋白定量。蛋白經變性處理后，取25 μg經10%SDS-PAGE在90 V恒定電壓下電泳2 h，300 mA恒流2 h轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h;分別加入Met、p-Met、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、N-cadherin和GAPDH一抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），在4 ℃下孵育過夜;TBST漂洗5 min×3次，加入山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗（稀釋比例均為1 ∶ 2 000），在室溫搖床中孵育2 h;TBST漂洗5 min×3次，滴加ECL高敏曝光液，于Bio-Rad成像儀中進行顯影。以Image Lab 5.2.1軟件測定條帶的灰度值后，p-Met以Met為內參，p-PI3K以PI3K為內參，p-Akt以Akt為內參，Bcl-2和N-cadherin以GAPDH為內參，計算目標蛋白條帶與內參蛋白條帶灰度值的比值以表示目標蛋白的相對表達量。試驗重復3次。

2.7 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。試驗數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 五味子甲素對HONE-1細胞增殖的影響

與空白對照（0 μmol/L）比較，10、20、40 μmol/L五味子甲素處理24、48 h后細胞的增殖率均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且具有一定的濃度依賴性趨勢，提示五味子甲素能夠顯著抑制HONE-1細胞的增殖。不同濃度五味子甲素作用24、48 h后細胞增殖率測定結果見表1。

3.2 五味子甲素對HONE-1細胞遷移能力的影響

與空白對照（0 μmol/L）比較，10、20、40 μmol/L五味子甲素處理24 h后細胞的遷移率均顯著降低（P<0.01），提示五味子甲素能夠顯著抑制HONE-1細胞的遷移。不同濃度五味子甲素作用24 h后細胞遷移情況顯微圖見圖1，遷移率測定結果見表2。

3.3 五味子甲素對HONE-1細胞侵襲能力的影響

與空白對照（0 μmol/L）比較，10、20、40 μmol/L五味子甲素處理24 h后每視野下侵襲細胞數均顯著減少（P<0.01），提示五味子甲素能夠顯著抑制HONE-1細胞的侵襲。不同濃度五味子甲素作用24 h后細胞侵襲情況顯微圖見圖2，每視野下侵襲細胞數見表2。

3.4 五味子甲素與Met蛋白的活性口袋分子對接結果

分子對接結果顯示，五味子甲素能與Met蛋白的活性口袋穩定結合（C-score=5），并且“包埋”在Met的活性口袋內，這提示五味子甲素發揮其生物學功能可能是通過影響Met蛋白及其下游信號通路來介導的。五味子甲素的三維結構及其與Met蛋白的活性口袋分子對接情況見圖3。

3.5 五味子甲素對HONE-1細胞中Met/PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的影響

與空白對照（0 μmol/L）比較，10、20、40 μmol/L五味子甲素處理24 h后細胞中p-Met、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2和N-cadherin蛋白的相對表達量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。不同濃度五味子甲素作用24 h后細胞中p-Met、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2和N-cadherin蛋白表達的電泳圖見圖4，蛋白相對表達量測定結果見表3。

4 討論

雖然當前鼻咽癌以現代醫學的治療方法（放療聯合化療）為主，但是中醫藥方面一直積極參與探索。中醫藥辨證論治在中晚期鼻咽癌和術后不良反應中發揮了重要的作用，其優點有降低毒副作用、顯著減輕癥狀或延長帶瘤生存期等[12]。

目前，多種中藥及其有效成分展示了良好的抗鼻咽癌活性，如山楂酸能通過PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路誘導鼻咽癌細胞自噬，進而抑制細胞增殖[13];蘿卜硫素能夠顯著誘導鼻咽癌細胞凋亡[14];苦參堿衍生物能夠通過增加抑癌miRNA（如miR-146b-5p）的表達，抑制鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲[15]。五味子甲素是一種從五味子果實中提取出來的具有生物活性的木脂素成分，具有抗炎、抗腫瘤和抗纖維化等多方面的藥理學作用[16]。本研究通過CCK-8試驗、劃痕試驗和Transwell小室試驗發現，五味子甲素處理后，人鼻咽癌細胞HONE-1的增殖、遷移和侵襲能力均明顯減弱，這提示五味子甲素具有良好的抗鼻咽癌活性。

Met蛋白是由位于7號染色體上的Met原癌基因編碼的，具有酪氨酸激酶作用的跨膜受體，其配體是肝細胞生長因子，當其與肝細胞生長因子結合后，Met蛋白被磷酸化激活[17]。已有臨床研究表明，在鼻咽癌細胞放射治療過程中Met蛋白可以被異常激活，繼而引起鼻咽癌細胞放化療耐受[18-19]。此外，還有研究表明，Met蛋白的表達與鼻咽癌患者的淋巴結轉移和遠處轉移有關[20-21]。過往研究中，多種針對Met蛋白的抑制劑均展示出了良好的抗腫瘤效果。本研究通過計算機分子對接發現，五味子甲素能夠與Met蛋白的活性口袋穩定結合。通過Western blotting試驗發現，五味子甲素能夠抑制Met蛋白的磷酸化。而Met蛋白磷酸化后可以激活PI3K-Akt、促分裂原活化蛋白激酶 （MAPK）、信號傳導及轉錄激活因子（STAT）等信號分子[22-23]。目前，已有研究證實，由Met介導活化的PI3K/Akt通路與鼻咽癌的多種惡性生物學行為如異常增殖、放化療耐受、血管形成及遠處轉移等密切相關[24]。本研究進一步通過Western bloting試驗檢測了五味子甲素對PI3K/Akt信號通路及其下游蛋白Bcl-2、N-cadherin表達的影響，發現其能夠顯著抑制PI3K/Akt信號通路的活化及其下游蛋白Bcl-2、N-cadherin的表達。

綜上所述，五味子甲素能夠通過抑制Met/PI3K/Akt信號通路的活化來抑制鼻咽癌細胞HONE-1的增殖、遷移和侵襲。五味子甲素有望開發為一種良好的抗鼻咽癌藥物，但還需要更多的研究進一步證實。

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（收稿日期：2020-07-04 修回日期：2020-08-17）

（編輯：林 靜）