柚皮苷對脂多糖刺激下成骨細胞堿性磷酸酶活性、骨保護素mRNA和RANKL mRNA的影響

秦紅霞，張坦，郭春杰

(鄭州大學第一附屬醫院 口腔科，河南 鄭州 450000)

牙周炎的發展伴隨著牙周支持組織的破壞，可造成牙槽骨吸收、牙周袋形成，甚至導致牙齒松動或拔除。菌斑微生物是牙周炎的始發因素。致病菌斑微生物通過與宿主發生免疫應答反應，破壞牙周支持組織。除了菌斑微生物及其代謝產物造成的破壞外，宿主對過強的免疫應答反應產生的抗炎因子也會對組織造成破壞，尤其對骨組織造成破壞。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，可直接作用于成骨細胞。LPS對MC3T3-E1細胞的抑制呈現濃度依賴性，隨著LPS濃度的升高，對MC3T3-E1細胞的抑制作用越明顯[1]。LPS能夠明顯抑制MC3T3-E1骨結節的形成以及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性[2]。柚皮苷是一種雙氫黃酮類化合物。研究表明，柚皮苷不僅可以促進成骨細胞的增殖分化[3]，還可以抑制破骨細胞對骨的吸收[4]。但是目前關于柚皮苷抑制骨吸收的作用機制的研究較少。本實驗通過LPS誘導MC3T3-E1細胞形成牙周炎的體外成骨細胞骨吸收模型，以不同濃度的柚皮苷為研究對象，采用反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測成骨細胞骨保護素(osteoprotegerin，OPG)mRNA和核因子κB受體活化因子配體(nuclear factor κB receptor activator ligand，RANKL)mRNA表達水平，旨在為臨床醫生使用柚皮苷治療牙周炎和根尖周炎提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器柚皮苷(四川曼斯特生物科技有限公司)；LPS、CCK-8試劑盒(中國索萊寶)；MC3T3-E1細胞(中國醫學科學院基礎醫學研究所)、α-MEM培養基、胎牛血清(北京全式金生物)；ALP活性檢測試劑盒(中國碧云天)；RT-PCR試劑盒(日本Takara公司)；全波長酶標儀(美國Perking Eilmer公司)；PCR儀(Eppendorf mastercycler，德國)。

1.2 成骨細胞培養將原代MC3T3-E1細胞復蘇，檢測細胞密度達80%～90%后再進行傳代培養，細胞離心后，將細胞懸液按1∶2進行傳代，每隔2 d換液1次，取第3代細胞進行后續實驗。標記部分細胞后放入液氮罐儲存。

1.3 實驗分組取傳代后的MC3T3-E1細胞，以每孔1×104的密度接種于96孔板，每孔200 μL，培養24 h后，將細胞隨機分為5組。空白對照組：加入等量的二甲基亞砜，未做其他處理。LPS組：加入終濃度為1 mg·L-1的LPS。低濃度組：加入終濃度為2 mg·L-1的柚皮苷+1 mg·L-1的LPS。中濃度組：加入終濃度為10 mg·L-1的柚皮苷+1 mg·L-1的LPS。高濃度組：加入終濃度為20 mg·L-1的柚皮苷+1 mg·L-1的LPS。對低濃度組、中濃度組、高濃度組預先用1 mg·L-1的LPS處理2 h后，再各自加入相應濃度的柚皮苷溶液。

1.4 檢測指標

1.4.1CCK-8檢測成骨細胞增殖情況 將每組細胞均設6個復孔，在細胞培養箱里培養24 h后再按一定比例加入(每孔20 μL)CCK-8試劑，孵育2 h后用酶標儀在450 nm處測定吸光度。操作3次取平均值。

1.4.2ALP 將細胞接種至6孔板中過夜，待細胞長滿70%～80%時開始加藥，分組情況同1.3項。培養3 d后收取細胞，胰酶消化完將細胞分成3管。一管加入RIPA裂解液提取蛋白，用酶標儀在570 nm波長處測定吸光度值求算蛋白濃度。一管加入Trizol裂解液用來提取RNA。剩余一管用南京建成生物工程研究所的微量酶標法來檢測培養細胞的ALP。胰酶消化細胞前先收集細胞培養液用來測定培養液的ALP，使用酶標儀在520 nm處測定各孔的吸光度。ALP活性=(待測樣品吸光度值-空白樣品吸光度值)/(標準品吸光度值-空白樣品吸光度值)×標準品濃度/待測樣品的總蛋白濃度。操作3次取平均值。

1.4.3RT-PCR檢測成骨細胞OPG mRNA、RANKL mRNA的水平 取1.4.2項中加入Trizol裂解液的成骨細胞，提取成骨細胞總RNA。采用日本Takara公司的反轉錄試劑盒將細胞總RNA反轉錄成cDNA，使用熒光定量PCR儀測定，設置反應條件：95 ℃預變性30 s，隨后95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸30 s，共設置40個循環。操作3次取平均值。PCR引物序列由上海生工生物技術公司合成，見表1。

表1 PCR引物序列

2 結果

2.1 柚皮苷對成骨細胞增殖能力和ALP活性的影響與空白對照組比較，LPS組成骨細胞增殖能力和ALP活性均較低(P<0.05)。低濃度組、中濃度組、高濃度組的成骨細胞增殖能力和ALP活性均高于LPS組(P<0.05)。低濃度組成骨細胞增殖能力和ALP活性均高于中濃度組和高濃度組，中濃度組成骨細胞增殖能力和ALP活性均高于高濃度組(P<0.05)。見表2。

表2 柚皮苷對成骨細胞增殖能力和ALP活性的影響

2.2 柚皮苷對成骨細胞OPG mRNA和RANKL mRNA的影響(1)LPS組OPG mRNA表達水平低于空白對照組(P<0.05)。低濃度組、中濃度組、高濃度組OPG mRNA表達水平均高于LPS組(P<0.05)。低濃度組成骨細胞OPG mRNA表達水平高于中濃度組和高濃度組，中濃度組成骨細胞OPG mRNA表達水平高于高濃度組(P<0.05)。(2)LPS組RANKL mRNA表達水平高于空白對照組(P<0.05)。低濃度組、中濃度組、高濃度組RNAKL mRNA表達水平均低于LPS組(P<0.05)。低濃度組成骨細胞RNAKL mRNA表達水平低于中濃度組和高濃度組，中濃度組RNAKL mRNA表達水平低于高濃度組(P<0.05)。見表3。

表3 柚皮苷對成骨細胞OPG mRNA和RANKL mRNA的影響

3 討論

牙周炎是常見的口腔感染性疾病。在全國第四次口腔健康檢查中，中國有80%～96%的成年人存在不同程度的牙周問題。牙周炎是引起成年人牙齒喪失的主要原因。牙周炎不僅影響著人類的口腔健康，還與全身多種疾病的發生息息相關，如糖尿病、心血管疾病以及癌癥等。

LPS是破壞骨組織及誘發炎癥反應的關鍵因素，不僅會刺激炎癥因子的釋放，還能抑制牙周膜干細胞分化，導致牙槽骨吸收甚至增加牙周炎的發病率。LPS會激活成骨細胞NF-κB信號通路。據報道，向骨折小鼠腹腔注射LPS可以使骨折延期愈合[5]。這表明LPS可以直接抑制成骨細胞的分化。在本實驗中，在1 mg·L-1的LPS刺激下，成骨細胞增殖能力下降，ALP活性降低，OPG mRNA水平下調，RANKL mRNA水平上調。這表明1 mg·L-1的LPS可直接抑制MC3T3-E1細胞的成骨分化。

柚皮苷是從天然藥物和水果中分離提純出來的一種RANKL抑制劑。近些年關于柚皮苷對骨代謝和骨形成的影響已經受到廣泛的關注。人羊水源性干細胞是一種新型的治療骨疾病的成骨細胞。Liu等[6]用柚皮苷刺激人羊水源性干細胞，結果發現柚皮苷不僅可以促進人羊水源性干細胞增殖分化，增加ALP活性，還可以通過BMP和Wnt/β-catenin信號通路來增加OPG表達、抑制RANKL表達，進而促進人羊水源性干細胞成骨分化，抑制其向破骨細胞分化。在本實驗中，加入柚皮苷后可促進成骨細胞增殖，提高ALP活性，提升OPG mRNA水平，降低RANKL mRNA水平。RANKL是TNF配體家族成員，當RANKL與破骨細胞表面的RANK結合時，破骨細胞的分化和功能增強，從而發生骨吸收[7]。OPG被稱為破骨細胞抑制劑，可由成骨細胞產生，RANKL和OPG的相對比值被認為是調節破骨細胞生物學和骨吸收的決定性因素和最終步驟，而且這一比值受到各種成骨激素、細胞因子和藥物的調節[8]。這表明柚皮苷溶液通過刺激成骨細胞OPG mRNA的表達，抑制RANKL mRNA的表達，導致OPG/RANKL比值升高，進而體現了柚皮苷對骨吸收的抑制作用，這與現有的研究結果[9]一致。Li等[10]用2、4、8、10、20 mg·L-1柚皮苷處理MC3T3-E1細胞，結果顯示不同濃度的柚皮苷均可促進成骨細胞增殖，提高ALP活性，2 mg·L-1柚皮苷的成骨作用最顯著，隨著柚皮苷濃度的升高，成骨促進作用變小。這與本實驗結果一致，即當柚皮苷濃度為2 mg·L-1時，抑制骨吸收的作用最明顯。

綜上所述，柚皮苷可降低LPS刺激下成骨細胞RANKL mRNA水平，上調OPG mRNA水平，進而抑制骨吸收，并且當柚皮苷的濃度為2 mg·L-1時的效果最顯著。這對臨床醫生使用柚皮苷治療根尖周炎和牙周炎提供了理論依據。