HPLC-DAD法測定狹葉金粟蘭不同部位中綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶的含量

馮云霞，戢太陽，馮協和，劉 菁

0 引言

狹葉金粟蘭(ChloranthusangustifoliusOliv)為金粟蘭科(Chloranthaceae)藥用植物之一[1]，又名“四塊瓦”、“小四塊瓦”或“四葉對”等[2]，最早見于清代的《植物名實圖考》。狹葉金粟蘭在不同的地區以全草或根莖入藥，其具有活血散瘀、消腫解毒的功效，臨床上多用于治療風濕性關節炎和菌痢等[3]。狹葉金粟蘭的化學成分[4]主要有二聚倍半萜類化合物、單倍體倍半萜類化合物、香豆素類、酰胺類，其提取物具有抗菌[5]和殺蟲[6]作用。研究證明，香豆素類成分是金粟蘭科植物發揮抗菌消炎作用的主要成分[7]，傘形花內酯和異嗪皮啶即是狹葉金粟蘭香豆素類成分中的2種。被《中國藥典》收錄的狹葉金粟蘭同科藥材腫節風還將異嗪皮啶作為含量測定的指標之一[8]。目前對于狹葉金粟蘭的研究較少，主要是成分研究和藥理活性研究[9-11]，對其質量控制尚缺乏相關研究。本試驗建立了HPLC-DAD法測定狹葉金粟蘭不同部位(根、莖、葉)中綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶的含量，以期為狹葉金粟蘭藥材的質量控制和狹葉金粟蘭資源的合理開發利用提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UltiMate 3000型高效液相色譜儀(DIONEX)(四元梯度泵、二極管陣列檢測器)，LGC-1025M型柱溫箱及Chromeleon色譜數據工作站；HC1003型精密天平(上?；ǔ备呖芼=1 mg)；PTY-224型分析天平(美國普力斯特d=0.01 mg)；DFT-100型手提式粉碎機(上海新諾儀器設備有限公司，功率：400 W)；HT-9013A型電熱恒溫干燥箱(東莞華臺測試儀器有限公司)；US-15D超聲波清洗器[中科儀(北京)儀器有限公司，清洗頻率：40 kHz]。

1.2 試藥 狹葉金粟蘭樣品分別于2018年6月23日采自湖北省丹江口市六里坪鎮和2018年7月14日采自湖北省竹山縣上庸鎮，采集的樣品由湖北醫藥學院陳吉炎教授鑒定，確定為金粟蘭科植物狹葉金粟蘭ChloranthusangustifoliusOliv。綠原酸對照品(批號：101023-201705，純度：99.15%，上海融禾醫藥科技發展有限公司)、傘形花內酯對照品(批號：101402-201609，純度：99.2%，中國藥品生物制品檢定所)、異嗪皮啶對照品(批號：110821-201501，純度：98.77%，中國藥品生物制品檢定所)；乙腈(色譜純，天津賽孚瑞科技有限公司)；磷酸(分析純，南昌瑞鈴化工有限公司)；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 樣品預處理 狹葉金粟蘭樣品在采集時要求選取的植株生長年限一致，采集時要保證植株完好。將采集到的樣品植株的根、莖和葉分離，每3個單株作為一個樣品，共得到根、莖和葉樣品各6份，分別編號為狹葉金粟蘭根01～06號樣品、狹葉金粟蘭莖01～06號樣品、狹葉金粟蘭葉01～06號樣品。將得到的樣品清除雜質，于鼓風干燥箱中干燥，用粉碎機粉碎并過60目篩、備用。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶對照品適量，用甲醇溶解后制成質量濃度分別為0.368 7、0.016 7、0.054 3 mg/ml的溶液，用0.22 μm濾膜過濾，濾液即為混合對照品溶液，用封口膜封口，置冰箱(2～5 ℃)中保存。

2.2.2 供試品溶液的制備 取預處理后的狹葉金粟蘭根、莖和葉粉末樣品2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入75%甲醇50 ml，采用加熱回流法提取1 h，放冷后再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量。補足重量后搖勻，濾過，再取續濾液，用0.45 μm濾膜過濾，即得。

2.3 色譜條件及系統適應性試驗 色譜柱：Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，進行梯度洗脫：0～9 min，12%～20%A；9～15 min，20%～25% A；15～25 min，25%～35% A；25～45 min，35%～45% A，45～60 min，45%～20%A；流速：1.0 ml/min；檢測波長330 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μl。

在上述色譜條件下，進樣“2.2.1”項下混合對照品溶液及“2.2.2”項下狹葉金粟蘭根01號供試品溶液。結果顯示，綠原酸保留時間約為8.34 min；傘形花內酯保留時間約為14.76 min；異嗪皮啶保留時間約為32.05 min；理論塔板數均不低于7 000；供試品色譜峰的DAD匹配值不低于999.13，說明供試品溶液中的綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶色譜峰與其相鄰的色譜峰分離較好。見圖1。

圖1 混合對照品與供試品HPLC圖注：A.混合對照品，B.供試品；1.綠原酸，2.傘形花內酯，3.異嗪皮啶

2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液，分別用甲醇稀釋成含綠原酸6.144 7、7.373 6、9.217 0、12.289 3、18.434、36.868 μg/ml，傘形花內酯0.278 7、0.334 4、0.418 0、0.557 3、0.836 0、1.672 0 μg/ml，異嗪皮啶0.904 7、1.085 6、1.357 0、1.809 3、2.714 0、5.428 0 μg/ml系列對照品溶液。按“2.3”項下色譜條件進樣分析，進樣量20 μl，記錄峰面積。以對照品的濃度為橫坐標(X)，綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶峰面積為縱坐標(Y)，繪制此3種成分的標準曲線，得綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶的回歸方程。其線性范圍、回歸方程和相關系數結果見表1。

表1 綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶回歸方程和線性范圍

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下含綠原酸0.368 68 mg/ml、傘形花內酯0.016 7 mg/ml、異嗪皮啶0.054 3 mg/ml的混合對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣測定，測定次數為6次，記錄綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶的峰面積。測定結果顯示，綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.28%、1.16%和1.37%，均在2%范圍內，說明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 稱取狹葉金粟蘭根01號樣品、狹葉金粟蘭莖02號樣品、狹葉金粟蘭葉05號樣品各6份，每份2 g，準確稱定后制備供試品溶液，制備方法如“2.2.2”項下所述，經0.45 μm濾膜濾過后按“2.3”項下的色譜條件進樣測定，進樣量20 μl，記錄綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶的峰面積。結果顯示，按含量計算，狹葉金粟蘭根中綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶的RSD分別為1.19%、1.14%、1.35%，狹葉金粟蘭莖中綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶的RSD分別為1.41%、1.37%、1.18%，狹葉金粟蘭葉中綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶的RSD分別為1.27%、1.33%、1.52%，說明該方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗 取狹葉金粟蘭根01號樣品、狹葉金粟蘭莖01號樣品、狹葉金粟蘭葉01號樣品各2 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，經0.45 μm濾膜濾過后，分別于0、1、2、3、6、9、12、24、48 h按“2.3”項下的色譜條件進樣測定，記錄綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶的峰面積。結果顯示，狹葉金粟蘭根中綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.48%、1.27%、1.16%，狹葉金粟蘭莖中綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.31%、1.27%、1.48%，狹葉金粟蘭葉中綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶峰面積的RSD分別為1.54%、1.22%、1.65%，說明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取狹葉金粟蘭根01號樣品6份，每份2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入75%甲醇50 ml，再加入含綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶質量濃度分別為0.368 7、0.016 7、0.054 3 mg/ml的混合對照品溶液1.0 ml，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，經0.45 μm濾膜濾過后，按“2.3”項下的色譜條件進樣測定，計算加樣回收率及RSD，結果見表2。

表2 加樣回收率結果(n=6)

2.9 樣品含量測定 分別稱取狹葉金粟蘭根01～06號樣品、狹葉金粟蘭莖01～06號樣品、狹葉金粟蘭葉01～06號樣品各2 g，準確稱定后制備供試品溶液，制備方法如“2.2.2”項下所述。制備好的供試品溶液按“2.3”項下的色譜條件，測定綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶的峰面積，根據標準曲線計算含量。測定結果見表3。

表3 狹葉金粟蘭不同部位中綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶的含量(μg/g)

3 討論

3.1 檢測波長的確定 二極管陣列檢測器(DAD)具有靈敏度高、噪音低、線性范圍寬等優點。《中國藥典》中異嗪皮啶的最大吸收波長為342 nm，而綠原酸的最大吸收波長為330 nm，傘形花內酯的最大吸收波長為327 nm，試驗中對綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶對照品溶液進行掃描，發現在330 nm波長下綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶均有靈敏度高的較強吸收，故最終決定檢測波長330 nm。

3.2 流動相的確定 流動相體系和流動相比例對所分析成分與相鄰峰的分離效果有主要影響。根據文獻[12-16]，本試驗分別探索了乙腈-0.1%磷酸溶液和甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相下，各成分的分析效果，結果發現，乙腈-0.1%磷酸溶液流動相對狹葉金粟蘭樣品的分離效果要更好。但以乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相進行分離時仍存在綠原酸和相鄰的雜質峰分離不好的情況，故本試驗又嘗試了改變乙腈和0.1%磷酸溶液的比例，采用梯度洗脫，并通過調節流速，控制柱溫，最終將綠原酸和相鄰的雜質峰進行了很好的分離。故最終確定了流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，并按“2.3”項下條件進行梯度洗脫。

3.3 提取方法的選擇 本試驗為了更好地提取狹葉金粟蘭根、莖、葉中的綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶，通過參考文獻[17-19]，對這3種成分的提取方法進行了探索，課題組分別對比了索氏提取法、超聲提取法和加熱回流法的提取效率，結果發現，加熱回流法提取的綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶含量較另2種方法更高。確定提取方法后，課題組又探索了提取時間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)、料液比(1∶10、1∶25、1∶50、1∶75、1∶100)對提取效率的影響。結果顯示，狹葉金粟蘭3個部位的提取方法都可以確定為：加熱回流法，75%甲醇作為溶劑，提取時間為1 h，料液比為1∶25。

3.4 含量測定結果 通過狹葉金粟蘭各部位中綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶的含量測定結果可知，狹葉金粟蘭根中的綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶含量最高，分別為184.34 μg/g、8.36 μg/g和27.14 μg/g。狹葉金粟蘭各部位中這3種成分的含量趨勢為：根>莖>葉，此結果與袁琴琴等[14]研究的同屬植物銀線草不同部位異嗪皮啶含量的差異相同，但各部分含量差異不及其研究結果中的差異之大。狹葉金粟蘭作為藥材使用時，不同地區使用的部位不同，有些地區以全草入藥，有些地區以根莖入藥，本測定結果說明，狹葉金粟蘭藥材中的綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶以根中最多，在使用狹葉金粟蘭時，可對其不同部位的藥理活性和臨床應用進行區別，以達到最好使用的效果。

4 結論

本試驗研究建立了HPLC-DAD法測定狹葉金粟蘭不同部位中綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶含量的方法，通過HPLC對狹葉金粟蘭不同部位中綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶含量進行了測定，結果顯示，狹葉金粟蘭不同部位中綠原酸、傘形花內酯和異嗪皮啶的含量次序為：根>莖>葉。試驗建立的方法簡便快捷、準確可靠，專屬性強，重現性高，可為狹葉金粟蘭藥材的資源開發和利用提供參考依據。