耐熱復配酶在再造煙葉生產過程中優化研究

劉恩芬，彭麗娟，陳正春，趙金濤，陳嶺峰，趙云燕

（1.云南中煙再造煙葉有限責任公司，云南 昆明 650001；2.云南煙草質量監督檢測站，云南 昆明 650001；3.云南中煙新材料有限責公司，云南 昆明 650001）

煙草物料用熱水浸泡萃取，經固液分離將煙草水溶物與煙草纖維等不溶物分離，所得纖維在紙機上成型成薄片片基，所得水溶物經蒸餾濃縮，得到煙草提取液，煙草提取液經過基料調配形成涂布液，然后將涂布液液浸涂到片基上，最后干燥得到再造煙葉產品。目前卷煙原料配方中大部分都添加一定經比例的再造煙葉，但再造煙葉存在煙雜氣較重、刺激性大、香氣降低、煙氣柔和度差等缺點。為解決以上問題，從改進萃取技術、優化再造煙葉原料結構，達到提高再造煙葉內在品質。本文通過系統分析再造煙葉加工工藝各工序中物料的關鍵組分變化，將適應處理工段工藝特性的復配酶解技術引入再造煙葉生產工藝中，對原料進行處理，提高浸提效率，調控化學組分，在提高原料利用率同時提升再造煙葉產品抽吸品質。

近年來，國內外發展了一系列針對煙梗的處理技術，特別是〔1〕基于纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶和蛋白酶的單一性降解作用形成的處理技術，降低煙梗中纖維素、半纖維素、果膠、淀粉和蛋白質等大分子組分物質來改善卷煙吸食品質。生物技術已成為發展最快、應用最廣、潛力最大、竟爭最為激烈科技領域之一，也是最有希望取得關鍵性突破的學科之一〔2〕。酶工程是微生物學和工程學相互結合、相互滲透等有機結合而產生的交叉學科，酶作為生物催化劑具有催化專一性好、效率高、作用條件溫和等優點，已廣泛應用于醫藥、食品、輕工、化工、能源、環保、檢測等領域，深刻影響著許多重要的科學和實踐領域。隨著酶學研究的進一步深入，利用酶技術改善煙草品質已經成為煙草行業的熱點。吳亦集等[3]研究了在煙梗和煙末萃取過程中加入果膠酶、半纖維素酶和蛋白酶，以及酶添加量、酶解溫度和酶解時間對煙末、煙梗中蛋白質、全纖維素和果膠含量及其萃取液中還原糖和氨基酸含量的影響。于興偉等[4]以黑曲霉h1為菌株，以煙梗為發酵培養基進行固態發酵。Gravely等[5]提出用E.caratavora培養液降解原料中的果膠和用Asetgillus及Aspergnlusoryzae降解煙梗中的纖維素的微生物酶解方法。Gaisch等[6]在煙草水溶液中加入蛋白酶，利用微生物代謝作用降解煙草水溶液中多肽等，此方法處理過的煙草中蛋白質的降解率可達50%以上。Geisis[7]發現同時加入E.caratavora（可以產生果酸酶）和T.Longirrachiatum（可以產生纖維素酶）可降解煙梗中果膠和纖維素，提高再造煙葉內在品質。本項目在不改變現有再造煙葉加工工藝前提下，將適應處理工段工藝特性的耐熱復配酶解技術引入再造煙葉生產工藝中，對原料進行高效處理，提高浸提效率，調控化學組分，有效降低再造煙葉加工工藝中的能耗及環境污染，具有重要的經濟價值和應用價值。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1）原料：梗原料來自云南中煙再造煙葉有限責任公司。

2）耐熱酶：本實驗所用高溫酶（固體和液體）來自于武漢新華揚，詳見表1。

表1 固體單酶技術要求

3）實驗試劑及儀器

實驗過程中所用到的溶劑和試劑，無特別說明外，均為分析純，其中用于GC-MS檢測相關試劑為色譜純，實驗中用到的小型儀器主要包括pH計（FE20，Mettler Toledo），PCR儀（PCT-0220，Biorad），超純水儀（CASCADA LSMK2，Pall），電導率儀（FE30，Mettler Toledo），電子天平（PL3002，Mettler Toledo），超低溫冰箱（DW-86L828，海爾），分光光度計（UV-1800，Shimadzu），微孔讀板機（Molecular Devices SpectraMaxM2e，美國），HPLC（安捷倫，1260）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 耐熱多酶復配體系的開發、優化及應用

利用云南中煙提供煙梗原料，用武漢新華揚生物股份有限公司銷售的耐熱酶進行篩選和復配研究，形成了五組固體耐熱復配酶配方和五組液體耐熱復配酶配方，具體配方組分如表2。

表2 固體復配酶配方比例

水和生物酶液量（溶劑）添加量煙梗原料量的7倍，生物酶添加量煙梗原料量的10%。五種耐熱復配酶對煙梗進行處理，將二級提取獲得的浸提液利用HPLC進行糖分分析，固形物進行組分分析，評價耐熱復配酶的作用效果。

1.2.2 多酶復合體系酶解工藝實驗操作方法（實驗室）

1）測定煙梗物料含水量：稱取10g煙梗物料置于玻璃平皿中，70℃烘干至恒重（約4h），稱量烘干后物料重量，計算含水量為67.7%。

2）稱取煙梗物料31g（相當于10g干物料）置于250mL三角瓶中，三角瓶放在82℃水浴鍋中升溫。

3）計算溶劑（水+復配酶）量：按照m（溶劑添加量）：m（煙梗） ＝7∶1，計算10g干物料所需溶劑量，稱取復配酶，并與一定體積水混合。溶劑放于燒杯中，并在82℃水浴中加熱，升溫78℃時加入到盛放煙梗物料的三角瓶中，手動攪拌，時間25min。

4）反應結束后，將三角瓶從水浴鍋中取出，溫度降至室溫后取浸出液，殘留酶活和利用HPLC主要成分變化。

2 耐熱復配酶作用結果與討論

2.1 還原糖的增加

利用耐熱復配酶處理煙梗，煙梗浸提液糖組分結果如表3所示。與對照（不添加酶）相比，添加耐熱酶處理實驗組浸提液中各種小分子糖含量相對較高，還原糖含量明顯增加，原因是耐熱復配酶對大分子淀粉和少量纖維素的降解作用。其中TIBLEME6和TIB-LEME9復配酶降解效果相對較好。

表3 復配酶處理煙梗浸提液糖組分分析

2.2 大分子物質的降低

將二級浸提獲得的固形物進行干燥，測定主要大分子物蛋白質、淀粉、纖維素和果膠含量變化，如圖1。與對照實驗相比，五種耐熱復配酶處理煙梗后，主要大分子物質蛋白質、淀粉、纖維素、果膠含量都有所降低。蛋白質含量過高，會產生刺激性糊味；淀粉、纖維素含量過高抽吸時一方面會增加焦油含量，產生萘酚等致癌物質，另一方面也會產生刺激、嗆咳、燒紙氣味；果膠含量過高，煙草香氣透發性不良，青雜氣較重，產生甲醇、乙酸等刺激氣味大分子物質的含量。通過耐熱復配酶在加工過中對大分子物質部分降解，在改善梗膏的的同時，提高再造煙葉的吸味質量，降低刺激性，增強煙氣香味。

圖1 二級浸提圖形物大分子物含量變化

2.3 原料梗處理后產品結構變化

五種耐熱復配酶處理煙梗后，破壞煙梗結構，使其大分子物質發生變化，測定其纖維素、半纖維素、木質素、蛋白質、淀粉和果膠含量均有一定變化，說明五種耐熱復配酶能夠降解煙梗中大分子物質，有助于改善再造煙葉品質。將經過復配酶高溫浸提的煙梗進行電鏡拍照，如圖2所示。經過耐熱復配多酶體系處理后，疏松煙梗結構成多孔纖維，提高煙梗煙葉浸提效率，增加再造煙葉的可填充性和燃燒性，使抽吸過程中燃燒相對更充分，降低有害物質的含量。

圖2 煙梗二級浸提固形物的顯微鏡照片

2.4 耐熱復配酶處理梗原料致香成份的變化

2.4.1 類胡蘿卜素降解產物的變化

類胡蘿卜素的降解產物具有明顯的致香作用，有利于醇和煙氣和增加香氣量。由表4看出，在再造煙葉生產過程中，與未經過酶處理獲得成品樣品相比，經過酶處理獲得的成品其類胡蘿卜素降解產物含量增加了22.8%；所選的10種類胡蘿卜素降解產物中，與對照相比，經酶處理后β-二氫大馬酮、二氫獼猴桃內酯、香葉基丙酮、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮 B、巨豆三烯酮 D、金合歡基丙酮A和金合歡基丙酮B的量都有不同程度地升高，其中β-二氫大馬酮增加量為29%，香葉基丙酮增加量為32%，巨豆三烯酮B增加量為35%，巨豆三烯酮D增加量為30%金合歡基丙酮 A增加量為30%，金合歡基丙酮B的量增加的量最多為53%。

表4 類胡蘿卜素降解產物的含量變化 μg／g

2.4.2 苯丙氨酸降解產物、西柏烷類降解產物和新植二烯的變化

與未經過酶處理獲得成品樣品相比，新植二烯的含量明顯升高，含量增加了38%（表5），新植二烯是一種C20聚類異戊二烯，在煙草中性揮發物中含量最高，是煙葉中重要的致香物質。該成分是煙葉內含有的葉綠素在成熟和調制過程中降解形成葉醇，再由葉醇進一步脫水而形成的。新植二烯自身具有清香氣且刺激性較強，而葉綠素和葉綠醇則具有青雜氣。在調制過程中隨著葉綠素和葉綠醇大量轉化成新植二烯，煙葉的青雜氣消除，進而產生清香氣。新植二烯在煙草燃燒時可直接進入煙氣，具有減少刺激性、醇和煙氣的作用。新植二烯作為捕集煙氣氣溶膠內香氣物質的載體，具有攜帶煙葉中揮發性香氣物質和致香成分進入煙氣的能力，故又為煙葉的重要增香劑。

表5 西柏烷類降解產物中新植二烯的變化 μg／g

3 結論

1）添加耐熱酶處理實驗組浸提液中各種小分子糖和還原糖含量相對較高，對大分子糖淀粉和纖維素的降解有明顯作用；糖堿比得到了一定的提高，對改善梗絲的香氣品質有正面的協調作用，可以使再造煙葉產品燃燒更充分，起到降焦減害的作用。

2）經過耐熱復配酶處理過的梗原料，結構更加疏松，產品片基的吸釋性增強，有利用增加片基的涂布率，提高再造煙葉的抽吸品質。

3）從香氣成分的含量變化可以看出，在酶的催化作用下，物料的香氣前體物發生降解、加成和轉化等反應，使大分子降解為小分子，復雜結構轉化成簡單結構，獲得較強的致香能力。大部分香氣物質的含量增加，各種成分比例更趨協調。這種變化類似與在自然醇化時所經歷的化學變化，從而提高了再造煙葉的內在品質和感官質量。