地黃C3H基因的克隆及生物信息學分析

周延清 邵露營 郭萌萌 朱佳琳

摘 要：香豆酸-3-羥化酶屬于植物中最大的蛋白酶細胞色素P450家族之一，在植物生命活動中發揮著重要作用。為了解地黃香豆酸-3-羥化酶基因RgC3H合成毛蕊花糖苷的功能，該研究基于地黃代謝組學分析獲得KEGG途徑中的C3H，采用多重比對在NCBI中獲得同源基因的一個保守序列，并基于該保守序列和地黃SRA數據庫，采用電子克隆和RT-PCR克隆技術獲得地黃C3H基因全長CDS（RgC3H），對其進行生物信息學分析。結果表明：RgC3H基因全長為1 530 bp，且編碼一個含509個氨基酸、分子量為57.91 kD、無信號肽的蛋白質;基于氨基酸序列的結構分析顯示，RgC3H有一個保守區域-P450結構域;系統進化分析結果顯示，RgC3H與芝麻和猴面花的C3H基因具有很高的同源性。上述結果為進一步研究RgC3H基因在地黃毛蕊花糖苷生物合成途徑中的作用奠定了基礎。

關鍵詞：地黃，C3H基因，基因克隆，生物信息學分析

中圖分類號：Q943

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）09-1281-07

Abstract：Coumarin-3-hydroxylase belongs to the cytochrome P450 family，one of the largest protease families，and plays an important role in plants. However，its role for verbascoside biosynthesis remains deficient. In order to understand the role of P-coumarate 3-hydroxylase for verbascoside biosynthesis in Rehmannia glutinosa （RgC3H），C3H was mined from a candidate KEGG pathway based on the metabolomics analysis of R. glutinosa，and a conserved sequence of homologous gene was obtained in NCBI by multiple alignment. According to its fragment and SRA database of R. glutinosa，we cloned its full length CDS （RgC3H） by electro cloning and RT-PCR，and performed its bioinformatics analyses. The results were as follows：RgC3H gene was 1 530 bp in length and encoded a 509-amino acid protein with a molecular weight of 57.91 kD and without signal peptide; According to its amino acid sequence and structural analysis，RgC3H contained one conserved domain-cytochrome P450 domain，suggesting that it belonged to cytochrome P450 family; Phylogenetic tree analysis showed that RgC3H had high homology with the C3H genes of Sesamum indicum and Erythranthe guttata. This study laid a foundation for further research on the role of RgC3H gene in the pathway of verbascoside biosynthesis in Rehmannia glutinosa.

Key words：Rehmannia glutinosa，C3H gene，gene cloning，bioinformatics

地黃是“四大懷藥”之一，屬于玄參科地黃屬多年生草本植物，是一種重要的傳統中藥藥材，種類繁多，具有益陰生津、清涼熱血等功效。目前，有關地黃的基因不斷被挖掘和分析，如地黃纖維素合酶基因（周延清等，2015）、RgTPI基因（邵露營等，2018）、RghBNG基因（張喻，2014）等，但明確相應功能的基因并不多。

香豆酸-3-羥化酶（p-coumarate 3-hydroxylase，C3H）屬于細胞色素P450中的CYP98亞家族，細胞色素P450參與木質素中間物的生物合成過程中，在植物生長發育過程中發揮重要作用（賀麗虹等，2008）。目前，C3H基因已在擬南芥（Schoch et al.，2001）、慈竹（周美娟等，2012）、苧麻（袁有美等，2017）等植物中逐步被鑒定。C3H是毛蕊花糖苷等多種物質生物合成途徑中的一條共有途徑-苯丙素途徑中的一個限速酶，地黃轉錄組測序挖掘出其Unigenes（Wang et al.，2017），地黃代謝組分析挖掘出C3H及其催化途徑（Zhou et al.，2018）。其與毛蕊花糖苷合成相關的作用被初步證實（Wang et al.，2017）。但是，地黃全長C3H基因的克隆及生物信息學分析尚未見報道。本研究基于地黃代謝組分析挖掘的C3H，采用同源克隆、電子克隆技術結合RT-PCR的方法首次獲得了RgC3H全長CDS，并對其堿基序列及其編碼的蛋白質序列進行了生物信息學分析，為進一步研究其在地黃毛蕊花糖苷途徑中的作用及其他功能的開發應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

地黃品種溫85-5塊根，種植于河南師范大學實驗田。獲得的RgC3H基因部分保守序列：GAGTTCAGACCCGAGAGGTTTCAAGAGGAGG

ACATCGACATGAAGGGGACCGATTATCGGCTACTTCCGTTCGGGTCAGGACGGCGTATTTGCCCCGGTGCACAACTTGCTATCAACTTGGTG。RgC3H基因引物序列為（F：5′-ATGGCTATCCCTCTCCTCAT-3′，R：5′- GCAAAAGAAAAGAACCATA-3′），引物序列合成于英濰捷基（上海）貿易有限公司。瓊脂糖、溴化乙錠（四川維克奇生物科技有限公司），DNA Marker（DL2 000）（寶生物生物技術公司）

1.2 方法

1.2.1 目的基因RgC3H全長CDS的獲取 依據地黃代謝組學分析侯選KEGG通路挖掘出RgC3H酶（Zhou et al.，2018），并在NCBI數據庫中下載與地黃親緣關系較近物種的已知C3H的核苷酸序列進行同源比對，獲得C3H部分保守序列。找到地黃相關的SRA數據庫在Nucleotide Blast中輸入已知的部分序列，選擇高度相似的序列檢索地黃SRA數據庫進行電子克隆。用ORF Finder軟件預測RgC3H的完整ORFs，利用軟件primer primer 5.0設計用于RT-PCR的引物，并以溫85-5塊根的cDNA為模板，RT-PCR反應體系參照王向楠（2017）。RT-PCR 程序為95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s，引物退火溫度為53 ℃，退火時間為30 s，72 ℃延伸時間2 min，35 cycle;72 ℃終延伸10 min。RT-PCR結束后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。產物膠回收后送至上海金唯智公司進行測序得到RgC3H基因的編碼序列。

1.2.2 RgC3H的生物信息學分析 將測序得到的RgC3H完整CDS區，用NCBI在線分析工具ORF Finder查找該基因開放閱讀框ORF;用ProtParam對RgC3H蛋白進行理化性質分析;用TMHMM 2.0和NetPhos 3.1 Server對RgC3H蛋白質的跨膜區和磷酸位點進行預測分析;應用Signal P-5.0對地黃RgC3H氨基酸序列進行信號肽的分析。用SOPMA及SWISS-MODEL分別對RgC3H蛋白的二級和三級結構進行分析。用NCBI的CD search和InterProScan對RgC3H蛋白的結構域進行分析。利用NCBI在線工具Blast查找與RgC3H同源性較高的序列，運用軟件DNAMAN6.0進行同源性分析及采用MEGA 6.0軟件構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 目的基因RgC3H全長CDS的獲取

根據拼接得到的CDS序列設計引物，利用RT-PCR進行擴增，結果如圖1所示。PCR產物切膠回收送至上海金唯智公司進行測序所得基因序列結果如圖2所示。CDS全長為1 530 bp，編碼的蛋白共有509個氨基酸殘基。

2.2 RgC3H同源性分析及系統進化分析

通過NCBI的Blastn搜索與RgC3H基因核苷酸序列相似性較高的物種，用DNAMAN6.0多重比對結果表明RgC3H與芝麻[Sesamum indicum（NM_001304410.1）]、猴面花[Erythranthe guttata（XM_012972625.1）]、桃兒七[Sinopodophyllum hexandrum（KC110989.1）]、美花煙草[Nicotiana sylvestris（XM_009766650.1）]等物種的相似性分別依次為91%、82%、72%和70%（圖3）。

為進一步研究RgC3H在其他植物之間的進化關系，利用MEGA 6.0進行C3H蛋白系統進化樹的構建結果顯示，芝麻、猴面花與地黃親緣關系最近，率先聚為一支，后與美花煙草聚為一支，與相思木（Acacia koa，KX784942.1）、錦雞兒（Caragana sinica，HQ829858.1）、木槿（Hibiscus syriacus，JX003249.1）的親緣關系最遠（圖4）。

2.3 RgC3H理化性質、功能及結構域預測

2.3.1 RgC3H理化性質 應用ProtParam對RgC3H進行蛋白理化性質分析，發現其分子式為C2608H4136N706O727S28，分子量為57 911.50，氨基酸總數為509，等電點（pI）為8.89，帶負電荷的殘基（Asp+Glu）總數為60，帶正電荷的殘基（Arg+Lys）總數為67，估計的半衰期為30 h，不穩定指數為31.11，蛋白質類型為穩定蛋白質。脂肪指數為90.22，親水性的平均值（GRAVY）為-0.202。

2.3.2 RgC3H保守結構域預測 利用NCBI的Conserved Domain Database數據庫分析結果表明RgC3H的保守結構域含有P450超家族，即屬于細胞色素P450家族成員（圖5）。

2.3.3 RgC3H的跨膜區和磷酸化位點分析 用TMHMM2.0對RgC3H進行分析，結果表明RgC3H沒有跨膜結構，且是膜外蛋白質。用NetPhos 3.1 Server對RgC3H進行磷酸化結構預測得出，蘇氨酸磷酸化位點有26個;絲氨酸磷酸化位點有20個;酪氨酸磷酸化位點有12個。

2.3.4 RgC3H信號肽分析 利用Signal P-5.0 對地黃RgC3H 氨基酸序列進行信號肽的可能性分析，結果表明，RgC3H無信號肽，可推測該蛋白沒有跨膜運輸功能，不是分泌型蛋白。

2.4 RgC3H二級結構、三級結構預測分析

本文應用SOPMA及SWISS-MODEL分別對RgC3H的二級和三級結構進行分析，發現其中α螺旋占最多，為50.69%，其次是無規卷曲占33.99%，延伸鏈占9.43%和β轉角占5.89%（圖6、圖7）。

3 討論與結論

地黃是一種大宗中草藥，具有很高的觀賞、食用及藥用價值，其主要生物活性成分毛蕊花糖苷對其藥效意義重大。毛蕊花糖苷具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、光保護、護肝、保護神經和免疫調節等多種生物活性（Li et al.，2019）。但是，地黃毛蕊花糖苷含量很低，我國藥典規定地黃毛蕊花糖苷含量不小于0.02%。因此，需要解析地黃毛蕊花糖苷生物合成途徑，探索提高地黃毛蕊花糖苷含量。毛蕊花糖苷生物合成途徑有一條重要的苯丙烷合成途徑，與木質素合成途徑具有重疊步驟，而C3H正是兩者重疊途徑中的限速酶（Schoch et al.，2001），且前期研究已挖掘出了地黃C3H（Wang et al.，2017;Zhou et al.，2018 ）及其編碼基因RgC3H的Unigene（Wang et al.，2017）。但是，沒有克隆RgC3H全長基因和深入研究其合成毛蕊花糖苷的作用。

本研究基于地黃代謝組分析挖掘出C3H，采用同源克隆、電子克隆技術結合RT-PCR的方法首次獲得了RgC3H全長CDS，并對其堿基序列及其編碼的蛋白質的氨基酸序列進行了生物信息學分析，這些結果體現了我們建立的基因克隆技術具有綜合性、先進性和有效性;RgC3H測序結果為1 530 bp，生物信息學分析表明其編碼509個氨基酸，具有C3H酶類的保守P450結構域，這與前人從慈竹、苧麻、石榴等植物中克隆的C3H基因在基因大小、氨基酸殘基個數等方面的結果一致（周美娟等，2012;袁有美等，2017;熊楓等，2018）;RgC3H在氨基酸水平上與多種植物的C3H具有較高的同源性，且系統進化樹結果顯示，地黃RgC3H基因與芝麻（NM_001304410.1）和猴面花（XM_012972625.1）的C3H基因相似性分別高達91%和82%，這與他們同屬于管狀花目植物的分類地位相一致;采用SOPMA預測RgC3H蛋白二級結構表明該蛋白中主要由α螺旋和無規卷曲組成，延伸鏈和β轉角相對較少;經信號肽預測分析得出該蛋白是一種膜外蛋白質，無信號肽，沒有跨膜運輸功能。

綜上所述，本研究成功克隆并分析了地黃RgC3H基因，證明其屬于植物C3H基因家族。本研究工作的開展，擴大了已知地黃基因數據，為下一步揭示RgC3H在地黃毛蕊花糖苷生物合成途徑中的作用提供了有價值的基礎數據。但是，RgC3H合成地黃毛蕊花糖苷的真正作用有待進一步深入研究。

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（責任編輯 何永艷）