產殼聚糖酶內生真菌的篩選、鑒定及酶活力初步研究

金秋珠 顏楨靈 黃植清 袁海瑩 劉廣華 農小霞 李鑫 駱海玉

摘 要：植物內生真菌是挖掘不同類型殼聚糖酶及發現新酶的資源寶庫。該研究從122株柑橘和血散薯內生真菌中篩選能產生殼聚糖酶的菌株，對其進行鑒定，初步研究酶活力影響因素，為后期其酶學性質及產殼聚糖酶內生真菌與宿主植物病害防御互作關系的研究奠定基礎。通過透明圈法初篩結合液體發酵法進行復篩，得到2株可產生殼聚糖酶的內生真菌Stdif9和Stdif9-4，并發現Stdif9-4最高酶活力（0.968 U·mL-1）顯著高于Stdif9（0.780 U·mL-1）。采用形態學和分子生物學結合的方法將菌株Stdif9-4鑒定為青霉屬菌株，即Penicillium sp. Stdif9-4。通過DNS試劑法初步研究影響該菌株產殼聚糖酶活力的因素，發現不同培養時間對菌株殼聚糖酶活力具有顯著影響，在培養96 h時，殼聚糖酶活力達到最大值。9種金屬離子對菌株的酶活力具有不同影響，其中Mn2+和Ca2+對殼聚糖酶活力具有明顯的激活作用;Ag+、Zn2+、Cd2+、Ba2+和Fe3+對殼聚糖酶活力具有不同程度的抑制作用，并且Ag+的抑制作用最為顯著;K+和Na+對殼聚糖酶活力無顯著影響。不同培養代數菌株產酶活力無顯著差異，說明其產酶活力穩定。

關鍵詞：植物內生真菌，殼聚糖酶，酶活力，青霉屬，血散薯

中圖分類號：Q939.99

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）09-1332-09

Abstract：Endophytic fungi are good sources for exploring high diversity of chitosanase and discovering new enzymes. In this study，chitosanase-producing strains were screened and identified from 122 endophytic fungi associated with citrus and Stephania dielsiana，and the factors affecting the activity of chitosanase were preliminarily studied，in order to provide an experiment basis for further study on the enzymatic properties and the interaction between chitosanase-producing endophytic fungi and host plant resistance to diseases. Two endophytic fungi Stdif9 and Stdif9-4 were found to produce chitosanase by transparent circle method and liquid fermentation method. The highest activity of Stdif9-4 （0.968 U·mL-1） was significantly higher than that of Stdif9 （0.780 U·mL-1）. Stdif9-4 was identified as Penicillium sp. Stdif9-4 by morphological method and sequencing analysis of ITS gene. The factors affecting on the chitosanase activity were studied by DNS reagent method. The results showed that the chitosanase activity reached maximum at 96 h of cultivation. In addition，among the nine metal ions，Mn2+ and Ca2+ had obvious activation effect on chitosanase activity. Ag+，Zn2+，Cd2+，Ba2+ and Fe3+ had different inhibitory effects on chitosanase activity，and Ag+ showed more significant inhibitory effect，while? K+ and Na+ did not show significant effect on enzyme activity. There was no significant differences in enzyme activity between different cultured generations，which indicate that the enzyme activity is stable.

Key words：plant endophytic fungi，chitosanase，enzyme activity，Penicillium，Stephania dielsiana

自1973年Monaghan et al.（1973）首先報道了殼聚糖酶（chitosanase）是一種不同于幾丁質酶的新酶以來，殼聚糖酶的基礎與應用研究已成為目前的研究熱點。殼聚糖酶不水解膠態幾丁質，但能夠水解完全脫乙酰化的殼聚糖，所以該酶被認為是專一性水解線性殼聚糖的酶，主要存在于真菌、細菌及植物中（魯晶娣等，2018）。近年來，大量研究表明，殼聚糖酶可以作為生物防治劑，能提高植物的抗病能力，與細胞壁的降解、營養代謝等均密切相關，在回收利用甲殼素中的氮和碳素等方面也起著重要的作用（Kouzai et al.，2012;Thadathil & Velappan，2014;Radhakrishnan et al.，2017;魯晶娣等，2018）。此外，其水解產物殼寡糖具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、促進傷口愈合等多種獨特的生理活性和功能，在醫藥、食品、化妝品等領域中具有廣闊的應用前景（Aam et al.，2010;Park & Kim，2010;Jaiswal et al.，2019）。

不同微生物來源的殼聚糖酶的種類及性質具有較大差異。植物內生真菌是探索不同種類殼聚糖酶及發現新酶的資源寶庫（Rajulu et al.，2011;Venkatachalam et al.，2015）。目前，對植物內生真菌殼聚糖酶的研究仍然極少。植物內生真菌是指在其生活史中的某一階段或全部階段生活在健康植物體各類組織內而不引起宿主植物產生明顯病害癥狀、與宿主植物互惠共生的真菌（Abdalla & Matasyoh，2014）。Rajulu et al.（2011）首次從陸生植物內生真菌中篩選產幾丁質修飾酶的菌株，發現其中37%的內生真菌可產生多種類型的殼聚糖酶。Venkatachalam et al.（2015）從海藻和海草的117株內生真菌中發現41%的菌株產生的殼聚糖酶可水解脫乙酰度為56%的殼聚糖，66%的菌株產生的殼聚糖酶可水解脫乙酰度為38%的殼聚糖，56%的菌株產生的殼聚糖酶可水解脫乙酰度為1.6%的殼聚糖。Rajulu et al.（2011）和Venkatachalam et al.（2015）的研究均發現來源于不同植物的同種內生菌的酶具有高度多樣性。

植物中普遍含有內生真菌，種類繁多。從植物內生真菌中篩選產殼聚糖酶菌株將有利于發現種類豐富多樣的殼聚糖酶，也將有利于水解產生多種不同類型的殼寡糖，為農業、醫藥業及食品工業等提供更多有利資源。本研究從柑橘和血散薯的122株內生真菌中篩選產殼聚糖酶的菌株，初步研究酶活力影響因素，為后續進一步研究其酶學特性和功能、明確產殼聚糖酶內生真菌與宿主植物互作關系等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物內生真菌

122株植物內生真菌為廣西師范大學珍稀瀕危動植物生態與環境保護教育部重點實驗室化學生態實驗室前期從健康柑橘（Citrus spp.）和血散薯（Stephania dielsiana）植株中分離得到。柑橘樣品采自廣西桂林（110°19′44″ E、25°16′13″ N，110°16′36″ E、25°11′5″ N）、梧州（111°1′18″ E、23°29′46″ N）;血散薯采自廣西來賓市金秀瑤族自治縣（109°59′34″ E、24°16′10″ N）。

1.2 儀器和試劑

主要儀器：超凈工作臺ZHJH-C1112C，上海智城;恒溫培養箱，韶關泰宏醫療器械;恒溫搖床LYZ-2102C，上海龍躍;生物顯微鏡DM3 000，德國徠卡;紫外可見光分光光度計UV-1 200，上海美普達。主要藥品試劑：DNS試劑（購自優品實驗室），殼聚糖（分子量29萬，脫乙酰度95%，購自浙江玉環澳興甲殼素有限公司），鹽酸溶液（購自西隴科學股份有限公司），氫氧化鈉（購自西隴科學股份有限公司），金屬離子鹽（所用的離子Na+、K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cd2+、Ba2+和Fe3+均為氯鹽，Ag+為AgNO3）。

1.3 培養基

1.3.1 活化培養基 用于菌種從低溫保存條件轉到室溫條件的活化適應，采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：去皮的馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH 7.0，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。

1.3.2 種子培養基 種子液同1.3.1，僅不添加瓊脂。

1.3.3 產殼聚糖酶菌株篩選培養基 參考張濤（2005）的方法，配制初篩和復篩誘導培養基。

A組分：1%膠體殼聚糖，pH 5.6。B組分：酵母粉0.1%，K2HPO4·3H2O 0.3%，KH2PO4 0.2%，MgSO4·7H2O 0.14%，NaCl 0.1%，KCl 0.1%，CaCl2 0.02%，瓊脂2%。C組分：土豆汁20%，葡萄糖0.2%，蛋白胨0.5%，酪蛋白0.2%，酵母浸膏0.5%，pH 5.6。以上A、B、C組分均單獨滅菌。其中，將A、B兩溶液等體積混合制得初篩固體培養基;將A、C兩溶液等體積混合制得復篩液體發酵培養基。

1.4 產殼聚糖酶菌株篩選

1.4.1 初篩（透明圈法篩選） 在超凈工作臺中，用無菌打孔器（直徑4 mm）在已活化的內生真菌菌落邊緣取菌餅，轉接至初篩培養基平板上，每皿接1塊菌餅，設置3個重復，于28 ℃培養，每天觀察菌株生長情況，并在有透明圈產生時，采用十字交叉法測量相應透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），記錄數據并拍照，計算D/d比值。挑選產透明圈明顯的菌株，進一步搖培發酵檢測酶活。

1.4.2 復篩 在超凈工作臺中，向裝有100 mL種子培養基的三角瓶（250 mL）中轉接3塊活化的菌餅，設置3個重復，28 ℃、150 r·min-1振蕩培養3 d，獲得種子液。用移液槍吸取2 mL種子液接入裝有100 mL復篩培養基的三角瓶（250 mL）中，設置3個重復，28 ℃、150 r·min-1振蕩培養3 d后，測定殼聚糖酶活力。

1.5 菌株鑒定

采用形態學結合分子生物學的方法對產殼聚糖酶的菌株進行鑒定。形態學鑒定菌株主要是通過不同的培養基（CA、PDA、CYA及G25N）對內生真菌進行培養，參考《真菌鑒定手冊》（魏景超，1979）、《中國真菌志》（孔華忠，2007）及相關文獻對其進行初步鑒定。鑒定特征包括菌落大小、形態、生長速率、邊緣特征、菌落及培養基基質顏色，以及菌落在顯微鏡下的特征（如菌絲有無分隔、分支，分生孢子形態、大小，產孢結構特征等）。分子生物學鑒定菌株主要是利用真核生物在rDNA的ITS區段具有保守性和特異性序列的特性，以真菌通用引物ITS1和ITS4擴增菌株ITS堿基序列，委托北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進行檢測純化及測序。將獲得的測序結果與NBCI數據庫中的序列進行BLAST比對，選擇相似度較高，親緣關系近的菌株比對，并用MEGA Ⅹ軟件，對ITS堿基序列進行聚類分析，Bootstrap進行自展次數為1 000的置信度檢測，根據系統發育樹中的組群關系對菌株進行分類。

1.6 殼聚糖酶活力測定

1.6.1 氨基葡萄糖標準溶液 準確稱取0.863 g氨基葡萄糖鹽酸鹽（105 ℃烘至恒重），置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉移到容量瓶中，用蒸餾水定容至1 000 mL，混勻，配制成4 μmol·mL-1氨基葡萄糖標準溶液，置于4 ℃冰箱中保存備用。

1.6.2 氨基葡萄糖標準曲線繪制 取6支洗凈的10 mL試管，依次加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL濃度為4 μmol·mL-1的氨基葡萄糖標準溶液，均加蒸餾水至1 mL，再分別加入1 mL DNS試劑，放入100 ℃的水中反應10 min后取出。冷卻后，加蒸餾水定容至10 mL，混勻。在520 nm波長處，以0號管調節零點，測定其他號試管溶液的吸光值。重復3次測量，計算出每支試管吸光值的平均值。

1.6.3 DNS法測殼聚糖酶活力 參考胡遠亮（2007）和劉昌燕等（2009）的方法，具體操作如下：首先，取0.5 mL發酵上清液和0.5 mL 1%膠體殼聚糖溶液，在50 ℃下保溫60 min。然后，向試管中加入1 mL DNS試劑終止反應，并轉至沸水中反應10 min，反應結束后用流動自來水進行降溫。最后，向試管中分別加入蒸餾水至每管溶液體積為10 mL。以煮沸失活的酶液作為對照，用分光光度計測量520 nm處的吸光值（OD520），根據氨基葡萄糖標準曲線方程計算出其對應的氨基葡萄糖濃度。按照以下公式計算酶活力：酶活力=（測定樣組的還原糖量-對照樣組的還原糖量）×2（稀釋倍數）/60（時間）。酶活力定義為每毫升發酵液每分鐘產生1 μmol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.7 菌株Stdif9-4產酶曲線測定

參照毛貴珠等（2012）的方法，并進行適當改良，按照1.4.2的操作方法，將種子液接入250 mL三角瓶中，每菌接3瓶，28 ℃、150 r·min-1振蕩培養，分別于24、48、72、96、120 h取發酵液離心（4 000 r·min-1，15 min），按照1.6.3方法測定上清液酶活力。

1.8 金屬離子對菌株Stdif9-4酶活力的影響

分別配制濃度為100 mmol·L-1的金屬離子（Na+、K+、Ag+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cd2+、Ba2+和Fe3+）溶液，然后分別向混有0.5 mL發酵上清液和0.5 mL 1%膠體殼聚糖溶液的試管中加入上述金屬離子溶液0.1 mL。按照1.6.3的方法測定酶活力，每個樣品做3個平行實驗。以不加金屬離子的空白對照組酶活力為100%，在金屬離子存在條件下的實驗組酶活力相對于空白對照組酶活力的比例即為添加金屬離子后的相對酶活力（高劍鋒等，2012）。即相對酶活力=實驗組酶活力/空白對照組酶活力。

1.9 菌株Stdif9-4酶活力穩定性測定

將菌株連續傳代培養五代，分別測定每代菌株產殼聚糖酶活力，以判斷菌株產酶活力是否穩定。從保種管內挑出Stdif9-4菌絲進行活化，作為第一代，培養3 d即轉接至新的PDA培養基內，新轉接菌株繼續培養3 d，作為第二代，再轉接，以此類推，至第五代。

2 結果與分析

2.1 氨基葡萄糖標準曲線方程

建立的氨基葡萄糖標準曲線方程為y=0.164 1x-0.003 3（R2=0.999 1），其中x為氨基葡萄糖濃度，y為不同濃度的氨基葡萄糖溶液的吸光值。

2.2 產殼聚糖酶內生真菌篩選

利用透明圈法，通過大量篩選，初步確定透明圈直徑/菌落直徑較大的2株內生真菌Stdif9和Stdif9-4（均分離自血散薯塊根）為產殼聚糖酶較好的菌株。進一步測定2株內生真菌Stdif9和Stdif9-4發酵液（培養3 d）的殼聚糖酶活力，結果如表1所示。發酵培養3 d的內生真菌Stdif9和Stdif9-4對95%脫乙酰度殼聚糖有較好的酶解作用，其殼聚糖酶活力分別達到0.780和0.968 U·mL-1，Stdif9-4殼聚糖酶活力顯著高于菌株Stdif9的。

2.3 2株內生真菌產殼聚糖酶活力曲線

分別測定內生真菌Stdif9和Stdif9-4在搖培24、48、72、96、120、144、168 h后的產酶活力，以確定其產殼聚糖酶活力最佳培養時間，結果如圖1所示。2株內生真菌在前72 h產酶活力均較低，72 h后產酶活力迅速增加，并均在96 h時產酶活力達到最大值，96 h之后產酶活力開始逐漸降低。從酶活力曲線可知，在不同的培養時間段，Stdif9-4菌株產酶活力均高于Stdif9。因此，后續選取Stdif9-4進行進一步研究。

2.4 內生真菌Stdif9-4的鑒定

采用形態學和分子生物學方法對內生真菌Stdif9-4進行鑒定。參考《中國真菌志》（孔華忠，2007），根據顯微形態圖（圖2），其分生孢子梗上只有一個分枝點，此分枝點上為單輪生的帚狀枝;分生孢子梗和分子孢子表面平滑;分生孢子球形或近球形。結合Stdif9-4在不同培養基上的菌落直徑（表2）和菌落形態（圖3）初步確定內生真菌Stdif9-4為青霉屬（Penicillium）菌株。結合分子生物學鑒定，將其測序結果與GenBank中的序列進行比對，發現其ITS序列與Penicillium sp.的相似性高達100%。因此，將Stdif9-4鑒定為Penicillium sp. Stdif9-4（GenBank登錄號為MN238849）。

2.5 金屬離子對內生真菌Stdif9-4殼聚糖酶活力影響

在確定Stdif9-4殼聚糖酶活力最高的發酵時間（96 h）的基礎上，測定了9種金屬離子（Na+、K+、Ag+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cd2+、Ba2+和Fe3+，濃度均為100 mmol·L-1）對酶活力的影響，結果如表3所示。Mn2+和Ca2+對Stdif9-4所產的殼聚糖酶活力具有明顯的激活作用;Ba2+和重金屬離子Ag+、Zn2+、Cd2+、Fe3+對殼聚糖酶活力都有不同程度的抑制作用，其中Ag+的抑制作用最為顯著;K+和Na+對殼聚糖酶活力無顯著影響。

2.6 內生真菌Stdif9-4產殼聚糖酶穩定性測定

將內生真菌Stdif9-4轉接繼代培養五代，分別測定相應發酵液殼聚糖酶活性，發現酶活性無顯著差異（圖4）。圖4結果表明該菌株產酶活力比較穩定。

3 討論與結論

通過平板初篩和液體復篩，從122株內生真菌中篩選到了2株產殼聚糖酶的菌株。采用形態學結合分子生物學的方法對其中產酶活力較高的菌株進行鑒定，將其歸為青霉屬。目前，人們從植物內生真菌中篩選產殼聚糖酶菌株的研究較少，主要還是從土壤、海洋等環境中進行篩選（Zitouni et al.，2017;Chien et al.，2018;Fukamizo & Shinaya，2019），而且發現的產酶菌株大多數為青霉屬（Penicillium）或曲霉屬（Aspergillus）（曾嘉，2002;鄭連英和隋斯光，2004;卓少玲，2012;單秋實，2015）。本研究篩選到的產殼聚糖酶的內生真菌Penicillium sp. Stdif9-4也為青霉屬菌株，分離自我國重要藥用植物血散薯塊根。由于不同來源的殼聚糖酶的酶學性質往往有較大差異，Penicillium sp. Stdif9-4來源于藥用植物，其特殊的生境是否會使得其殼聚糖酶的結構、功能有別于其他環境菌株，其對殼聚糖的作用類型是內切型還是外切型等，后期還需進一步研究。此外，不同培養基及不同營養成分配比對不同菌株的生長及酶的誘導往往有不同程度的影響，在進行初篩的過程中，由于只用了一種選擇培養基，這很可能會導致漏篩一部分產殼聚糖酶的菌株。因此，后期可嘗試多種含殼聚糖的培養基進行篩選。

發酵時間對殼聚糖酶活力有顯著影響。Peni-cillium sp. Stdif9-4產殼聚糖酶活力在前72 h均較低，72 h后迅速增加，并在96 h時達到最大值，隨后逐漸降低。這與張翔等（2018）、張子瑞（2016）報道的結果相似。與之相應的，王欽宏和蔡靜平（2000）發現產酶活力最高時，培養液中活菌數也達到了最高水平，并確定3 d為適宜的收獲時間。推測可能因為在發酵初期，培養基內的營養物質充裕，菌體大量繁殖，產生大量的殼聚糖酶，后期由于營養物質的減少及菌體進入衰亡期，殼聚糖的產生也隨之減少（熊妍妍等，2018）。本文僅研究了發酵時間對殼聚糖酶活力的影響，接種量、培養基各營養成分（如碳源、氮源等）以及培養條件（如溫度、pH等）等因素也均可影響殼聚糖酶活力，后期可利用單因素實驗結合正交實驗或響應面分析等進行綜合分析，以確定最有效促進產殼聚糖酶活力提高的條件。

大部分殼聚糖酶活性均可受金屬離子的影響。本研究使用8種氯鹽分別提供了8種金屬離子（Na+、K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Cd2+、Ba2+及Fe3+）和AgNO3提供Ag+，考察不同金屬離子對酶活力的影響。其中，Mn2+和Ca2+對Stdif9-4殼聚糖酶活力具有明顯的激活作用。相似的，單秋實（2015）研究發現金屬離子Mn2+、Ca2+對來源于土壤的青霉（Penicillium sp. QS7）殼聚糖酶活力也具有促進作用;卓少玲（2012）也發現Ca2+對來源于土壤的青霉（Penicillium sp. M-2）殼聚糖酶活力具有促進作用。Mn2+和Ca2+對大多數微生物來源的殼聚糖酶活性具有激活作用（曾嘉，2002;郝日光，2005;段妍，2006）。Ba2+和重金屬離子Ag+、Zn2+、Cd2+、Fe3+對殼聚糖酶活力具有不同程度的抑制作用，K+和Na+對殼聚糖酶活力無顯著影響。這與大多數微生物來源的殼聚糖酶一致（逄玉娟，2004;段妍，2006;游清徽，2006;王艷君等，2012;張翔等，2018），但也有部分金屬離子對不同來源的殼聚糖酶活力起著相反的作用，如在單秋實（2015）的報道中，Zn2+對來源于土壤的青霉菌（Penicillium sp. QS7）殼聚糖酶活力具有促進作用。金屬離子對酶的影響機制，可能與金屬離子和底物殼聚糖形成穩定的復合物有關（陳小娥，2004）;或金屬離子通過參與殼聚糖酶活性中心的構建，結合酶活性中心以外的部位，增大酶與底物之間的親和力，使酶活力得到增強（Chen et al.，2005;楊立紅等，2013）;或由于金屬離子通過螯合作用，影響酶的構象，干擾酶對底物的降解作用，從而導致酶活力下降（王艷君等，2012）。并且，不同作用條件如溫度、pH、酶的濃度、底物濃度以及金屬離子本身的濃度都會影響其作用效果。后期應對以上作用條件進行優化，并進一步研究不同金屬離子對菌株殼聚糖酶活力影響機制。

綜上所述，本研究從血散薯內生真菌中篩選到產殼聚糖酶活力穩定的青霉屬菌株，并初步研究了影響酶活力的因素。后期將進一步研究殼聚糖酶的酶學性質，對菌株產殼聚糖酶活力的最佳培養條件進行優化，進一步明確金屬離子促進殼聚糖酶活力的最佳濃度、復合效應及其作用機制，并測定殼聚糖酶及其水解產物的抗菌活性或誘導活性，及探究其與宿主植物病害防御互作關系。

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（責任編輯 周翠鳴）