林下參內生球毛殼菌FS-01對人參病原真菌的抑制作用

周春元 許世泉 閆梅霞 崔麗麗 華霜 王英平

摘 要：為探究林下參內生真菌球毛殼菌（Chaetomium globosum）FS-01菌株對人參病原菌的抑菌作用，該研究在實驗室條件下，測定了FS-01菌株菌絲、發酵液和孢子懸浮液對人參黑斑病菌（Alternaria panax）、人參菌核病菌（Sclerotinia schinseng）、人參灰霉病菌（Botrytis cinerea）、人參立枯病菌（Rhizoctonia solani）、人參根腐病菌（Fusarium solani）5種人參病原菌的抑制作用。結果表明：內生真菌球毛殼菌FS-01對5種病原菌均有抑制作用，其中，對人參黑斑病菌的抑制作用最高，為30.80%，其次是人參立枯病菌、人參菌核病菌、人參根腐病菌和人參灰霉病菌;發酵液抑菌實驗結果表明，在加入內生真菌球毛殼菌FS-01菌株發酵液的PDA培養基上，對人參灰霉病菌的抑制作用最高，為82.09%，其次是人參菌核病菌、人參黑斑病菌、人參立枯病菌和人參根腐病菌;孢子抑菌實驗結果表明，在加入內生真菌球毛殼菌FS-01菌株孢子懸浮液的PDA培養基上，對人參黑斑病菌的抑制作用最高，為83.72%，其次是人參灰霉病菌、人參立枯病菌、人參菌核病菌和人參根腐病菌。綜上結果認為，內生真菌球毛殼菌FS-01菌株對人參病原菌均有很高的抑菌作用，可作為人參病原菌的生防菌株資源。

關鍵詞：林下參，內生真菌，球毛殼菌，人參病原菌，抑制作用

中圖分類號：Q945.8

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2020）09-1341-08

Abstract：To study the inhibitory effects of Chaetomium globosum strain FS-01 against Alternaria panax，Sclerotinia schinseng，Botrytis cinerea，Rhizoctonia solani and Fusarium solani of ginseng pathogens，mycelia，fermentation broth and conidia suspension were tested in laboratory. The results showed that Chaetomium globosum FS-01 had certain inhibitory effects against five kinds of? ginseng pathogens by confront culture. Among them，the highest inhibition rate to mycelia growth of Alternaria panax，reached 30.80%，followed by Rhizoctonia solani， Sclerotinia schinseng， Fusarium solani and Botrytis cinerea; On the PDA plate mixed with Chaetomium globosum FS-01 fermentation broth，the highest inhibition rate to mycelia growth of Botrytis cinerea，reached 82.09%，followed by Sclerotinia schinseng， Alternaria panax，Rhizoctonia solani and Fusarium solani; On the PDA plate mixed with Chaetomium globosum FS-01 conidia suspension，the highest inhibition rate to mycelia growth of Alternaria panax，reached 83.72%，followed by Botrytis cinerea， Rhizoctonia solani， Sclerotinia schinseng and Fusarium solani. Endophytic fungi FS-01 strain had a significant inhibitory effects，it could be utilized as a biological control resource inhibiting ginseng pathogens.

Key words：mountain-cultivated ginseng，endophytic fungi，Chaetomium globosum，ginseng pathogen，inhibitory effects

人參（Panax ginseng）屬五加科（Araliaceae）人參屬（Panax）多年生草本植物。這種植物具有巨大的藥用價值，其根部常被用來增強脾肺功能，以及預防心血管疾病、腦血管疾病、慢性代謝綜合癥和糖尿病等（Briskin，2000;Shibata，2001;Yuan et al.，2012）。人參是一種在同一個地方生長緩慢的宿根植物。因此，人參面臨著一系列的環境脅迫，包括細菌、真菌、線蟲對其侵染。目前，國內外已有記載的人參病害有40多種，我國已發現的人參病害至少有25種以上（王春偉，2011），嚴重影響了人參產業的健康發展。人參主要的病原菌有人參黑斑病菌（Alternaria panax）、人參菌核病菌（Sclerotinia schinseng）、人參灰霉病菌（Botrytis cinerea）、人參立枯病菌（Rhizoctonia solani）、人參根腐病菌（Fusarium solani）等（鐘嘉麗等，2015;張雷鳴等，2016;盧占慧等，2016;孫卓和楊利民，2015，2016），直接影響了人參的產量和品質。

目前，防治人參病害主要利用化學藥劑。化學藥劑不僅價格昂貴而且對于防治病害的效果較差。此外，過度使用化學藥劑會導致土壤中微生物環境的變化。況且，這些化學藥劑對人類和植物有害，并且可能導致病原菌產生耐藥性（Kalia & Gosal，2011）。用植物內生菌防治人參病害國內外已有很多報道（李鵬祥等，2013;Eo et al.，2014）。內生菌被定義為其生活史全部或部分生活在植物組織內，通常對寄主植物不造成影響和傷害的微生物類群（Rodriguez et al.，2009;Park et al.，2017）。內生菌在植物病害防治中扮演著重要的角色（Chowdhury et al.，2017）。內生菌通過激活細胞對病原菌的防御反應、氧化反應、加固細胞壁、相關防御酶反應和次生代謝產物積累等，從而增強宿主抵御病害的能力（Ernst，2010）。內生菌在植物體內具有穩定的生存空間，不易受環境條件的影響，因此，利用內生菌防治植物病原菌既是一種環境友好型又是一種經濟有效的方法。

本研究利用前期從林下參葉片分離的內生真菌球毛殼菌（Chaetomium globosum）為研究對象，明確球毛殼菌、孢子懸浮液和發酵液對人參病原菌的抑制作用，以期更好地防治人參主要病害，并為尋找新型生物菌肥的研制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 球毛殼菌菌株FS-01 由中國農業科學院特產研究所實驗室提供（周春元等，2019）。人參黑斑病菌（Alternaria panax）、人參菌核病菌（Sclerotinia schinseng）、人參灰霉病菌（Botrytis cinerea）、人參立枯病菌（Rhizoctonia solani）、人參根腐病菌（Fusarium solani）由吉林農業大學植物保護學院植物病理教研室提供。

1.1.2供試培養基 PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。PD液體培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 儀器和設備 HZQ-F160振蕩培養箱，哈爾濱市東聯生化儀器有限公司;PL4002精密電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;BMJ霉菌培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠;SW-CJ-IFD潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠;Nikon TS倒置相差顯微鏡，日本尼康公司;PL4002電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 球毛殼菌FS-01與人參病原菌平板對峙培養 將保存的球毛殼菌FS-01菌株和供試人參病原菌菌株分別轉接到PDA平板上，于25 ℃黑暗條件下恒溫培養7 d后，用5 mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅。采用兩點對峙平板培養法，將人參病原菌菌餅分別接種于PDA平板一側，距離人參病原菌菌餅1 cm處接入球毛殼菌菌餅，同時以只接種人參病原菌的平板為對照（CK），每個處理重復3次，置于25 ℃黑暗條件下恒溫培養7 d，觀察記錄結果并拍照（劉彩云等，2015）。抑制率計算公式如下：

T=（Rc-Rp）/Rc×100%。

式中：T為抑制率;Rc為只接種人參病原菌菌落生長直徑平均值;Rp為對峙培養人參病原菌菌落生長直徑平均值。

1.2.2 球毛殼菌FS-01發酵液對人參病原菌的抑制作用

1.2.2.1 發酵液的制備 將保存的球毛殼菌FS-01菌株在PDA平板上活化7 d后，在無菌的條件下，用5 mm打孔器打取10個菌餅，轉接到裝有100 mL PD液體培養基的250 mL錐形瓶中，于黑暗條件下25 ℃、120 r·min-1轉速恒溫搖床上振蕩培養7 d，無菌條件下，將培養的菌液經滅菌的雙層紗布過濾除去菌絲，濾液經5 000 r·min-1離心15 min去除沉淀，上清液經孔徑為0.22 μm的細菌過濾器過濾得到球毛殼菌FS-01無菌發酵液，置于冰箱（4 ℃） 中保存備用（宋勇等，2018）。

1.2.2.2 發酵液對人參病原菌菌絲生長的抑制作用 吸取2 mL制備好的發酵液，加入40～45 ℃的PDA平板中，混勻，以加入2 mL無菌水的平板作對照，將人參病原菌菌餅接種于平板中央，置于25 ℃恒溫培養箱中培養，培養7 d后采用十字交叉法測量菌落生長直徑（方中達，1998），抑制率計算公式如下：T=（Rc-Rp）/Rc×100%。

式中：T為抑制率;Rc為無菌水處理平板中人參病原菌菌落生長直徑平均值;Rp為發酵液處理平板中人參病原菌菌落生長直徑平均值。

1.2.3 球毛殼菌FS-01孢子懸浮液對人參病原菌的抑制作用 將球毛殼菌菌株在恒溫培養箱中培養7 d，用滅菌針刮取分生孢子，加入無菌水配置成孢子懸浮液，用血球計數的方法將溶液配成濃度為每毫升1×107個孢子懸浮液母液，隨后將母液稀釋成每毫升1×106、1×105、1×104、1×103個不同濃度的孢子懸浮液。吸取1 mL制備好的懸浮液，加入40～45 ℃的PDA平板中，混勻，以加入1 mL無菌水的平板作對照，將人參病原菌菌餅接種于平板中央，置于25 ℃恒溫培養箱中培養，培養7 d后采用十字交叉法測量菌落生長直徑（索相敏等，2018）。抑制率計算公式如下：

T=（Rc-Rp）/Rc×100%。

式中：T為抑制率;Rc為無菌水處理平板中人參病原菌菌落生長直徑平均值;Rp為孢子懸液處理平板中人參病原菌菌落生長直徑平均值。

2 結果與分析

2.1 球毛殼菌FS-01菌絲對人參病原菌的抑制作用

從表1可以看出，球毛殼菌FS-01菌絲對人參病原菌均有不同程度的抑制作用，其中，對人參黑斑病菌的抑制作用最高，為30.80%，其次是人參立枯病菌、人參菌核病菌、人參根腐病菌，抑制率分別為24.37%、21.39%、19.07%，對人參灰霉病菌抑制率最小，為18.53%。當球毛殼菌FS-01菌絲與人參病原菌菌絲對峙培養7 d時，均會產生抑制區域，球毛殼菌FS-01菌絲與人參菌核病菌和人參灰霉病菌培養，產生的抑制區域明顯，與人參黑斑病菌、人參立枯病菌和人參根腐病菌培養，產生的抑制區域不太明顯（圖1）。

2.2 球毛殼菌FS-01發酵液對人參病原菌的抑制作用

從表2可以看出，球毛殼菌FS-01發酵液對人參病原菌均有不同程度的抑制作用。其中，對人參灰霉病菌的抑制作用最高，為82.09%，其次是人參菌核病菌、 人參黑斑病菌、 人參立枯病菌，抑制率分別為76.83%、74.04%、73.88%，對人參根腐病菌抑制率最小，為69.22%。在球毛殼菌FS-01發酵液平板上，人參病原菌菌落被包圍（圖2）。

2.3 球毛殼菌FS-01孢子懸浮液對人參病原菌的抑制作用

當孢子懸浮液濃度為每毫升1×107個時，球毛殼菌FS-01孢子懸浮液對人參病原菌均有不同程度的抑制作用，其中，對人參黑斑病菌的抑制作用最高，為83.72%，其次是人參灰霉病菌、人參立枯病菌、人參菌核病菌，抑制率分別為81.99%、76.19%、68.77%，對人參根腐病菌抑制率最小，為62.19%（表3）。在球毛殼菌FS-01孢子懸浮液平板上，人參病原菌菌落被包圍（圖3）。

3 討論

目前多采用五氯硝基苯、噁霉靈、多菌靈、咯菌腈、代森錳鋅、多抗霉素、丙環唑、嘧菌酯等多種化學農藥防治人參病害，但研究表明人參病原菌對以上農藥逐漸產生了抗藥性（Saito et al.，2016），亟需尋求新的防治人參病害的方法，以減緩病原菌抗藥性的產生。內生菌生存在植物體內，有穩定的生存空間，可以長期地定殖于植物體A. 球毛殼菌FS-01與人參黑斑病菌對峙培養; B. 球毛殼菌FS-01與人參菌核病菌對峙培養;? C. 球毛殼菌FS-01與人參灰霉病菌對峙培養; D. 球毛殼菌FS-01與人參立枯病菌對峙培養; E. 球毛殼菌FS-01與人參根腐病菌對峙培養。

A. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 and Alternaria panax; B. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 and Sclerotinia schinseng; C. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 and Botrytis cinerea; D. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 and Rhizoctonia solani; E. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 and Fusarium solani.

A. 球毛殼菌FS-01發酵液與人參黑斑病菌對峙培養（反面）; B. 球毛殼菌FS-01發酵液與人參菌核病菌對峙培養（反面）; C. 球毛殼菌FS-01發酵液與人參灰霉病菌對峙培養（反面）; D. 球毛殼菌FS-01發酵液與人參立枯病菌對峙培養（反面）; E. 球毛殼菌FS-01發酵液與人參根腐病菌對峙培養（反面）。

A. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 fermentation broth and Alternaria panax （reverse side）; B. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 fermentation broth and Sclerotinia schinseng （reverse side）; C. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 fermentation broth and Botrytis cinerea （reverse side）; D. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 fermentation broth and Rhizoctonia solani （reverse side）; E. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 fermentation broth and Fusarium solani （reverse side）.

A. 球毛殼菌FS-01孢子懸浮液與人參黑斑病菌對峙培養（反面）; B. 球毛殼菌FS-01孢子懸浮液與人參菌核病菌對峙培養（反面）; C. 球毛殼菌FS-01孢子懸浮液與人參灰霉病菌對峙培養（反面）; D. 球毛殼菌FS-01孢子懸浮液與人參立枯病菌對峙培養（反面）; E. 球毛殼菌FS-01孢子懸浮液與人參根腐病菌對峙培養（反面）。

A. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 conidia suspension and Alternaria panax （reverse side）; B. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 conidia suspension and Sclerotinia schinseng （reverse side）; C. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 conidia suspension and Botrytis cinerea （reverse side）; D. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 conidia suspension and Rhizoctonia solani （reverse side）; E. Confrontation culture of Chaetomium globosum FS-01 conidia suspension and Fusarium solani （reverse side）.內，不易受外界環境條件的影響，與病原菌可以直接互作，是一類重要的生防菌資源（Aly et al.，2011）。

球毛殼菌（Chaetomium globosum）是毛殼菌中研究最早的生防菌（Martin & Moore，1995），具有產生抑菌物質的能力（Soytong et al.，2001），廣泛應用于病害的防治。印容等（2016）研究表明球毛殼菌（Chaetomium globosum）產生的鞘氨醇類物質，對油菜根腫菌具有較強的抑制作用;蘭楠等（2011）從油菜中分離到的內生球毛殼菌YY-11在平板對峙試驗中，對油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、棉花立枯菌（Rhizotonia solani）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、油菜白斑病菌（Cerosphorella albo-maculans）、油菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）、油菜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、小麥赤霉菌（Fusarium graminearum）都有抑制作用。本研究以前期獲得的優勢菌株球毛殼菌 FS-01為材料，通過內生菌菌絲對峙培養、發酵液和孢子懸浮液抑菌試驗，研究其對5種人參病原菌的抑制作用。研究結果表明球毛殼菌 FS-01菌株對5種人參病原菌均有不同程度的抑制效果，具有廣譜性，可作為一種潛在的人參病害生物農藥。但是，內生真菌球毛殼菌 FS-01在活體上對病原菌的抑制能力是否與體外一致，以及抑菌機制、菌株發酵液中抗菌物質的活性成分和化學結構還有待于進一步深入研究。

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（責任編輯 周翠鳴）