CYP3A4和CYP1A2及CYP2E1快速免疫印跡檢測方法的建立*

何俊奇， 楊暢， 陸定艷， 李靖， 劉歡， 王永林， 劉亭**

(1.貴州醫科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室 & 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 藥學院， 貴州 貴陽 550025)

細胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP450)，又稱混合功能氧化酶(mixed function oxidase)和單加氧酶(monooxygenase)，是人體的主要藥物代謝酶之一，參與了超過90%的藥物代謝過程，主要存在于肝組織中[1-3]。CYP450包括多種酶，如CYP3A4、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C11、CYP2D6及CYP2C19等，其中CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1作為最為重要的幾種藥物代謝酶，對其蛋白表達情況的檢測更是在藥物代謝研究中作為非常常見的檢測步驟[4-6]。免疫印跡法(Western blot)作為蛋白檢測中的定性與半定量方法，在蛋白表達的檢測過程中最為常見[7]，其原理就是將總蛋白按照分子量的大小進行凝膠電泳分離，然后將目的蛋白轉移到比如聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)或者碳酸纖維素膜(notrocelluose filter membrane，NC)上，然后用特異性的抗原與其結合，從而對蛋白的表達進行檢測研究[8-10]。CYP450的Western blot檢測時間較長，一般需要12 h以上[11-12]。因此本文對Western blot實驗中最耗時的“封閉和抗體孵育”步驟加以優化，以期提高檢測效率。此外，CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1大多在肝臟高表達，如富含于肝臟勻漿、S9及肝微粒體，也是代謝實驗中常見的檢測樣品。HepG2細胞是目前常用的藥物吸收、分布、代謝、排泄(absorption，distribution，metabolism and excretion of drugs，ADME)模型細胞，監測細胞中CYP450的表達水平，可推測其在體內的代謝機理[13-16]。美國Millipore公司的SNAP i.d.2.0 Western blot快速孵育儀是一種利用真空抽壓的方式加速蛋白抗原抗體結合的儀器，能夠有效縮短抗體的孵育時間[17]。因此，本文選擇了HepG2細胞總蛋白、大鼠肝臟勻漿、S9及肝微粒體等代表性樣品，選用Western blot快速孵育儀來建立CYP3A4、CYP1A2和CYP2E1快速免疫印跡檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物及細胞 6只SPF級健康Sprague-Dawley雄性大鼠，體質量200～250 g，購自長沙天勤生物技術有限公司。人肝癌細胞HepG2購于上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophresis，SDS-PAGE)制備試劑盒、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸、牛血清白蛋白、吐溫-20、聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶)，改良杜氏伊格爾培養基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清(美國Thermo)，SDS-PAGE免染膠制備試劑盒(美國Bio-rad)，兔抗CYP3A4抗體、兔抗CYP2E1抗體、鼠抗CYP1A2抗體、辣根過氧化氫酶標記的山羊抗兔抗體及山羊抗小鼠(英國Abcam)，預染蛋白marker(上海優寧維)，放射免疫沉淀試驗(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液、超敏化學發光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒(上海碧云天)。

1.1.3主要儀器 SNAP i.d. 2.0 Western blot快速孵育儀(美國Millipore)，Trans-Blot Turbo蛋白快速轉膜儀、Mini-PROTEAN Tetra C型垂直電泳槽及PowerPac Basic型電泳儀(美國Bio-rad)，fresco 17冷凍高速離心機(美國Thermo)，Syngene G:BOX凝膠成像系統(英國Syngene)。

1.2 方法

1.2.1HepG2細胞樣品總蛋白的制備 人肝癌細胞HepG2用含10%胎牛血清的DMEM培養基，于37 ℃的5%CO2培養箱中培養。取細胞匯合度約90%的HepG2細胞，倒掉培養液，加4 ℃預冷的PBS磷酸鹽緩沖液3 mL洗滌細胞，棄洗液，重復洗滌2次。置于冰上加裂解液800 μL裂解，裂解完畢后將細胞液移入1.5 mL離心管中，渦混30 s，置于冰上反應5～10 min，12 000 r/min離心10 min(離心機提前預冷至4 ℃)，取上清液根據BCA試劑盒測定蛋白濃度后-20 ℃冷藏備用。

1.2.2大鼠肝組織勻漿蛋白、S9及微粒體的制備 大鼠喂養7 d脫頸處死，取肝臟浸泡于0.25 mol/L蔗糖溶液，洗去多余的血后于離心管中剪碎，加蔗糖溶液500 μL勻漿，再加蔗糖溶液補齊至4 mL，混勻后得大鼠肝組織勻漿蛋白樣品；取制備好的大鼠肝組織勻漿蛋白，9 000 r/min離心15 min(離心機提前預冷至4 ℃)，取上清液19 000 r/min離心20 min，取上清即得大鼠肝S9樣品；取制備好的的大鼠肝組織勻漿蛋白，于9 000 r/min離心15 min(離心機提前預冷至4 ℃)，取上清液16 000 r/min離心30 min，重復操作1次，上清液按1 mL加88 mmol/L CaCl20.1 mL 混合置于冰上靜止5 min(靜置振搖1次/min)，16 000 r/min離心60 min，棄上清液，0.1 mol/L pH 7.4的Tris溶液洗滌沉淀，加Tris緩沖液5 mL重新混懸，即得大鼠肝微粒體。所有樣品-20 ℃冷藏備用。

1.2.3蛋白濃度測定 分別取待測蛋白樣品10 μL，標準品0 、2 、4 、6 、8 、12 、16 及20 μL加到96孔板中，PBS稀釋液補至20 μL，各檢測3個復孔；各孔加 BCA工作液200 μL，37 ℃靜置反應30 min；酶標儀監測在562 nm處的吸光度，根據標準曲線和使用的樣品體積計算樣品的蛋白濃度。

1.2.4Western blot檢測 (1)以CYP3A4為對象，優化搖床封閉孵育條件，制備10%的SDS-PAGE常規凝膠和免染膠。取30 μg蛋白樣品與預染Marker上樣，80 V恒壓20 min，電壓調至120 V，繼續電泳70 min；電泳結束后，由下往上按照濾紙、PVDF膜、膠及濾紙的順利搭建轉膜“三明治”，并置于快速轉膜儀中轉膜；轉膜結束后，封閉孵育及分組見表1。(2)優化CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1的Western blot快速孵育儀封閉孵育條件：制備10%的SDS-PAGE常規凝膠，同前述進行電泳分離，快速轉膜儀轉膜30 min，封閉孵育及分組見表2。抗體孵育完畢后，在PVDF膜上加 ECL發光混合液1 mL，室溫反應1 min后放入凝膠成像儀器成像。

表1 搖床封閉孵育CYP3A4檢測條件Tab.1 CYP3A4 detection conditions of shaking incubation

表2 Western blot快速孵育儀孵育CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1檢測條件Tab.2 CYP3A4, CYP1A2 and CYP2E1detection conditions of Western blot rapid incubator

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CYP3A4搖床封閉孵育檢測條件優化

Western blot結果顯示，與A、B、D、E、F組相比，C組的檢測結果背景干凈且條帶表達均一；HepG2樣品檢測中，C組檢測靈敏度高于A、B、D、E及F組(P>0.05)；組織勻漿樣品檢測中，C組檢測靈敏度高于A、B、E及F組(P<0.05或P<0.01)，條帶均一性高于A、B組；S9樣品檢測中，C組檢測靈敏度高于A、B、D及E組(P<0.05或P<0.01)，條帶均一性高于A、B組；肝微粒體樣品的檢測中，C組檢測靈敏度高于A、B、D、E及F組(P<0.05或P<0.01)，條帶均一性高于A、B組。見圖1。

注：與B組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01，(3)P<0.001。圖1 不同條件下CYP3A4蛋白的檢測結果Fig.1 CYP3A4 detection results under different conditions

2.2 CYP3A4、1A2及2E1 Western blot快速孵育儀孵育檢測條件的優化

選擇2.1中優化的電泳條件對樣品蛋白進行分離、轉膜后，用Western blot快速孵育儀進行封閉和抗體孵育條件的篩選。CYP3A4結果顯示，HepG2、組織勻漿及S9樣品檢測中C組檢測靈敏度均高于A、B組(P<0.05或P<0.01)，肝微粒體樣品檢測中C組檢測靈敏度高于B組(P<0.001)，且上述4種樣品中C組背景均較A、B組干凈；CYP1A2結果顯示，HepG2、組織勻漿和S9樣品中，F組檢測靈敏度與D、E組比較差異無統計學意義(P>0.05)，肝微粒體中F組檢測靈敏度低于D組(P<0.05)，但F組條帶均一性均高于D、E組、且背景也較D、E組干凈；CYP2E1結果顯示，HepG2樣品檢測中I組檢測靈敏度高于與G、H組、但差異無統計學意義(P>0.05)，組織勻漿樣品檢測中I組檢測靈敏度高于G組(P<0.01)，S9樣品檢測中I組檢測靈敏度高于G、H組(P<0.01)，肝微粒體樣品的檢測中I組檢測靈敏度高于G組(P<0.05)，且上述4種樣品中I組條帶均一性及背景均較G、H組干凈。見圖2。

注：與C組比較，(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001;與F組比較，(4)P<0.05;與I組比較，(5)P<0.05,(6)P<0.01。圖2 不同快速孵育條件下CYP3A4、CYP2E1和CYP1A2蛋白檢測結果Fig.2 CYP3A4, CYP2E1 and CYP1A2 detection results under different rapid incubation conditions

3 討論

Western blot檢測作為一種常用的蛋白檢測技術，在CYP450蛋白檢測中運用非常廣泛，但是目前對于該方法的優化中大多是對洗脫時間及曝光時間進行優化，或者通過改變轉膜的時間與膜的孔徑來提高檢測效率，并沒有對于孵育方式及時間進行優化的先例[18]。CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1作為CYP蛋白家族中的重要成員，也是實驗中對于藥物代謝較為常見的CYP450酶[19]，因此本文選擇其作為檢測的對象[20-22]，建立CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1快速Western blot檢測方法。

本研究以CYP3A4為檢測對象，使用HepG2細胞總蛋白，大鼠肝組織的勻漿、S9及肝微粒體等樣品，對Western blot中分離膠類型、轉膜電壓與時間、封閉時間及抗體孵育時間等常規條件進行對比，篩選出了較為優化的檢測條件。結果表明使用常規的SDS-PAGE凝膠和快速轉膜30 min便可達到較好的分離和轉膜效果。因此，在以Western blot快速孵育儀進行快速檢測條件優化時，選用了較為經濟的常規SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，并采用了30 min快速轉膜條件。對快速封閉孵育條件優化實驗的結果表明，CYP3A4最佳快速檢測條件是一抗(3 ∶2 500)快速孵育儀孵育30 min，二抗孵育20 min；CYP2E1最佳快速檢測條件是快速孵育儀封閉30 min、一抗(3 ∶2 500)孵育20 min、二抗孵育10 min；CYP1A2蛋白快速檢測條件是以快速孵育儀封閉30 min、一抗(3 ∶2 500)孵育20 min、二抗孵育20 min。

在Western blot條帶圖中，可以明顯看到CYP3A4、CYP1A2及CYP2E1在微粒體中的豐度高于S9和勻漿中的量，這是因為大多數CYP酶存在于微粒體膜上[23-25]；而在HepG2組中，CYP3A4、CYP1A2和CYP2E1蛋白條帶的信號較弱，這與HepG2細胞中這3種CYP酶表達量極低相關[26]。說明實驗結果符合理論預期，也從側面證明了本文開發的方法的可靠性。

綜上所述，本文首先以CYP3A4為例，優化其常規Western blot檢測的孵育方式，然后再利用Western blot快速孵育儀對CYP3A4、CYP1A2和CYP2E1的孵育方式進行了優化。對比搖床孵育結果可以看出，優化的Western blot快速孵育條件在條帶一致性和背景等檢測效果上與常規搖床孵育的方式差異不大，但是極大縮短了檢測時間(12 h縮短至1 h)，提升了實驗效率。