木犀草素銅配合物的制備及其對DNA的裂解作用研究

臧 昕，王家文，林 悅，楊 昆，李 歡，申貴男，李 婧

(黑龍江八一農墾大學 生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319)

木犀草素(3',4',5,7-Tetrahydroxy Flavone)，具有多樣的生物化學和藥理作用，如抗菌、抗氧化、降血脂及膽固醇等。近期研究發現，金銀花、荊芥、菊花等天然中藥材中的木犀草素在用作抗病毒藥物時，對SARS-CoV-2的主要蛋白酶結合位點具有很高的親和力[1]。木犀草素在與鋅、錳、鎂等微量元素形成配合物后，部分生理活性得到明顯提升，并具有更加多樣的生物特性[2-5]。開發新型木犀草素金屬配合物，有利于了解黃酮類化合物與金屬的絡合形式，研究新型具有生理活性的物質。本實驗用木犀草素分別與新戊酸酮、苯甲酸銅進行反應制成銅配合物，分析其化學組成，并研究配合形式及對DNA的裂解能力。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器、藥品

樣品的紅外譜圖以KBr為壓片材料在Nicolet 380 型紅外光譜儀上測得；紫外譜圖由Thermo Scientific 紫外分光光度計測得；元素分析在Vario Micro cube上測定，凝膠電泳使用美國BIO-RAD紫外凝膠成像系統進行圖譜分析。

瓊脂糖購自Spanish公司；pBR322 DNA購自美國Fermentas公司；EB(溴化乙錠)購自北京博奧拓達；木犀草素購自上海賢鼎公司。

1.2 合成步驟

1.2.1 配合物1的合成

木犀草素(4 mmol)充分溶解于10 mL無水乙醇，新戊酸酮(2 mmol)充分溶解于10 mL無水乙醇；將溶液混合并震蕩，置于75℃水浴中回流70 min，冷卻，過濾，收集沉淀，干燥后即得黑色產物，產率為78.66%。IR(峰值，cm-1)：3423 s,1637 m,1590 m,1535 w,1482 s,1350 m,1257 s,809 m。

1.2.2 配合物2的合成

木犀草素(4 mmol)充分溶解于10 mL無水乙醇，苯甲酸酮(2 mmol)充分溶解于10 mL無水乙醇；將溶液混合并震蕩，置于75℃水浴中回流70 min，冷卻，過濾，收集沉淀，干燥后即得黑色產物，產率為73.35%。IR(峰值，cm-1)：3432 s,1630 m,1600 m,1600 s,1534 w,1480 m,1351 m,1256 m,810 m。

1.3 配合物對pBR322 DNA的裂解實驗

1.3.1 原料與產物對pBR322 DNA的作用能力

以瓊脂糖凝膠電泳法測試木犀草素及其銅配合物對pBR322 DNA的作用效果，并通過美國BIO-RAD紫外凝膠成像系統來分析所得圖像。

將木犀草素、新戊酸銅、苯甲酸銅、銅配合物1、銅配合物2充分溶解于 DMSO，調節各樣品濃度，使其均為300 μg/mL。向每個EP管中加入1 μL的各樣品，接著將6 μL的pH值為7.3的Tris-HCl緩沖溶液加入其中，再滴入1 μL的pBR322 DNA(150 μg/mL)，均勻混合，使體積總和為8 μL；同時以1 μL DMSO溶劑代替樣品，設置DNA陰性對照組。

將溶液混合均勻，于37℃恒溫、避光的環境中水浴反應3 h。待反應時間達到后，將 2 μL的Loading buffer與剛取出的8 μL產物迅速、均勻混合，上樣到具有溴化乙錠(1.0 μg/mL)的瓊脂糖凝膠板(瓊脂糖含量：0.8%)上，在電泳儀中加入配制好的TAE緩沖溶液，在80 V/cm的電壓下進行持續電泳。

1.3.2 木犀草素配合物濃度對pBR322 DNA的裂解能力的影響

將配合物1和配合物2的樣品，依次稀釋為7個質量濃度：300，225 ，150 ，75，37.5 ，18.75，9.38 μg/mL。取1 μL各濃度的樣品樣品與1μL 的pBR322 DNA(150 μg/mL)作用，操作步驟同上。

2 結果與分析

2.1 木犀草素銅配合物產率分析

將木犀草素與新戊酸酮和苯甲酸銅，分別按照以下6種物質的量比進行反應， 0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，反應中固定木犀草素用量。反應物在乙醇中于75℃恒溫水浴中，持續反應70 min，結果如下圖1所示。隨著物質的量之比不斷增加，至比值為1時，兩種配合物產率均達到最高，分別為78.66%(配合物1)和73.35%(配合物2)，然后反應產率持續下降。因此物質的量之比1∶1為最佳物質的量比。在制備配合物的過程中，其他溶劑如甲醇、乙腈、乙酸乙酯等也用來探索反應，但是實驗產品產率均不如在乙醇中好。

圖1 不同物質的量之比對產率的影響

2.2 木犀草素銅配合物的化學表征

2.2.1 紅外譜圖解析

木犀草素與銅配合物1和2的主要紅外吸收峰峰值如表1所示。

表1 木犀草素及其銅配合物的主要紅外吸收峰歸屬

與木犀草素相比較，配合物的羰基C=O吸收峰由1655 cm-1移到1637 cm-1和1630 cm-1，分別減少22 cm-1和25 cm-1，說明兩配合物中C環上的4-羰基均進行了配位。芳環C=C鍵由1612 cm-1分別減少至1591 cm-1和1600 cm-1。此外，兩配合物于809cm-1和810 cm-1處的特征吸收峰表明均存在金屬氧鍵，證明木犀草素的確與銅離子發生了配位。配合物中雙酚羥基C-OH的吸收峰分別下降18 cm-1和17 cm-1，說明雙酚結構保存，但由于受配位影響，發生位移。在配合物1中未發現新戊酸根的吸收峰，說明新戊酸根沒有參與到配合物的形成，同樣苯甲酸根也沒有參與配合物的形成。以上分析表明，配合物的結構組成為4-羰基，5-羥基配位銅的配合物。

2.2.2 紫外-可見光譜解析

木犀草素與銅配合物1和2的紫外特征吸收帶分布如表2所示。

表2 木犀草素及其銅配合物的紫外主要吸收峰波長

將木犀草素和配合物用DMSO溶解，配置成25 μg/mL的溶液，并在200 nm至600 nm光譜區間，在紫外分光光度計上進行紫外光譜掃描。

木犀草素在紫外光譜中出現兩個特征吸收峰，位于355 nm處吸收峰為帶Ⅰ，是環B的苯甲酰基，位于257 nm處的吸收峰為帶Ⅱ，是環A的桂皮酰基[6]。這兩處吸收峰均是由于發生ππ→π*躍遷引起[7]。配合物1和2的帶Ⅱ的吸收峰依次為266 nm和263 nm，較木犀草素有小幅度紅移，帶I的最大吸收峰較木犀草素分別紅移了80 nm和77 nm。

羥基黃酮類化合物通常有兩種配位位點，3'-OH、4'-OH和4-CO、5-OH。文獻報道木樨草素多以4-CO、5-OH的形式發生配位[7-9]。在本文銅配合物中木犀草素與銅離子發生配位，配位點也是C環上的4-CO和A環上的5-OH，形成穩定的環狀結構，此類情況配位時，4-CO通過共軛，影響到A環和B環兩個共振體系能級降低，從而導致兩個吸收峰發生紅移。

圖2 木犀草素銅配合物分子結構

綜合上述紅外與紫外譜圖中分析，考慮到峰頂取點誤差，兩組數據中吸收峰值的差別可以忽略。因此可以判斷配合物1和2在化學結構上相同，且酸根未參與配合物的形成。對配合物進行元素分析得到C:55.78%，H:2.96%；理論值C:55.26%，H:3.09%，推斷該配合物的結構式如圖2所示，分子中含有水分子。

2.3 木犀草素銅配合物對DNA裂解作用

作為具有抗四環素和氨芐青霉素的基因載體，超螺旋pBR322 DNA常常被用于測試化合物抗菌能力[8]。pBR322 DNA的Form I是超螺旋結構，在與金屬作用后會發生解超螺旋現象，形成Form II。本實驗中，將反應所用原料(木犀草素、苯甲酸銅、新戊酸酮)與反應所得到的配合物1和配合物2進行對DNA裂解能力比較，如圖3所示。木犀草素、苯甲酸銅和新戊酸酮對DNA裂解率分別為4.56%、6.71%、5.13%，基本無裂解能力，而配合物1和配合物2達到了則78.39%和 82.27%，說明木犀草素與Cu2+發生配合后，對pBR322 DNA的裂解能力有著顯著提升。此處表明兩種方法合成的樣品，具有相同的性能，進一步證明配合物結構相同。

1-Naked DNA；2-木犀草素；3-苯甲酸銅；4-新戊酸酮；5-配合物1；6-配合物2

為了進一步研究配合物的裂解作用，實驗選用配合物2測試在不同濃度下對DNA的裂解情況，如圖4。在配合物2中，隨著濃度的提高，裂解率也有著明顯的上升，在75 μg/mL時表現出裂解作用，且在300 μg/mL時，裂解率達到了最高84.16%。

1-DNA；2-DNA+9.38μg/mL；3-DNA+18.75μg/mL；4-DNA+37.5μg/mL；5-DNA+75.0μg/mL；6-DNA+150 μg/mL；7-DNA+225μg/mL；8-DNA+300μg/mL

3 結論

木犀草素金屬配合物具有多種生物活性，在本實驗中，利用木犀草素與新戊酸銅和苯甲酸銅分別反應生成配合物1和配合物2，利用紅外、紫外光譜等方法分析了木犀草素銅配合物的化學組成，并初步推測出在這兩種方法下合成的配合物結構相同，木犀草素通過C環上的4-C=O和A環上的5-OH與銅發生配位。此種配位形式在黃酮類化合物金屬配位物中較為典型。通過對pBR322 DNA的裂解活性研究表明，原料樣品對DNA沒有裂解作用，而在生成木犀草素銅配合物后，DNA裂解能力有了明顯的提升，并且隨著濃度的增大，裂解能力增強。此項研究為后續木犀草素銅配合物的深入研發奠定基礎。