大別山區域樹舌靈芝和云芝抗氧化活性研究

陳頤輝

(信陽農林學院 生物與制藥工程學院，河南 信陽 464000)

多孔菌科真菌 (Polyporaceac) 隸屬于真菌界 (Fungi) 擔子菌門 (Basidiomycota) 擔子菌綱 (Basidiomycetes) 傘菌亞綱 (Agaricomycetidae) 多孔菌目 (Polyporales)[1]，自然界已知的多孔菌科真菌約有500多種，中國發現300余種。多孔菌科真菌是一類研究利用較多的大型真菌，擁有較高的食藥用價值，如可食用的灰樹花、地花菌、硫磺菌等；常被用作中藥材的靈芝，紫芝，茯苓、豬苓等[2]，含有較強生理活性，具有滋補、健腦等功效，且具有良好的免疫活性、抗腫瘤活性、抗氧化活性等的藥用價值[3]。

大別山地區因其富饒的植被資源和適宜的環境，蘊含豐富的多孔菌科真菌資源，各學者也有針對其中菌種的藥理活性進行研究，但相關研究多集中于對靈芝(Ganoderma Lucidum Karst)，紫芝(Ganoderma sinense)等的多糖，萜類化合物[3-4]，其他菌株與成分研究則相對較少。多孔菌科真菌的抗氧化物可作用于清除自由基，減少脂質過氧化物的形成，增強機體抗氧化損傷的能力，防治腫瘤等[5]，同樣具有巨大的研究潛力。樹舌靈芝具有抗腫瘤、抗衰老、免疫調節抗病毒等功效，云芝具有恢復和增強帶腫瘤機體的免疫功能、防癌抗癌等功效[6-7]，但其抗氧化活性的特點目前研究較少。

本研究選擇大別山地區野生樹舌靈芝和云芝作為實驗材料，以信陽農林學院人工培養靈芝為對照材料，分離培養獲得樹舌靈芝和云芝的純種培養物；通過研究超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶的酶活性來探究其抗氧化活性特點，進而挖掘大別山地區多孔菌科真菌的種質資源特點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

樹舌靈芝與云芝栓孔菌均來自于大別山區域野外采摘，選擇信陽農林學院人工栽培靈芝為對照。二硫代對二硝甲基苯甲酸，鄰苯三酚，青霉素和鏈霉素等試劑均為分析純。

5415D微型離心機、UV752N紫外可見分光光度計、HH-6型數顯恒溫水浴鍋、DNP電熱恒溫培養箱、MS105DU電子分析天平、QHZ - 98A全溫度振蕩培養箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種培養及粗酶液制備

將樹舌靈芝、云芝及靈芝表面沖洗干凈，再用無菌水沖洗2～3次。無菌環境下，選取菌柄和菌蓋邊緣間的中心位置，用無菌手術刀切割0.3cm左右的組織塊，壓入加有青霉素和鏈霉素的PDA培養基中培養，在25℃恒溫培養箱中培養，待菌落長至直徑為2～3cm時，挑選少量菌絲在PDA培養基上純化2～4次，將純種菌絲轉接至PDA液體培養基中，25℃恒溫搖床震蕩培養12天[8]。無菌抽濾得到菌絲體，各稱取材料0.1g，加入預先配制過的pH值7.8的0.05mol/L磷酸鈉緩沖液5mL，冰浴研磨。在4℃ 10 000r/min高速離心15min，收集上清液，隨后用以測定酶活性[9]。

1.2.2 酶活性的測定

采用鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性[9]，參照郝俊江等[9]的方法測定CAT活性，參照王遲早等[10]的方法測定GPX活性，每組試驗重復三次，取數據平均值。

用Excel軟件對試驗數據進行統計。

2 實驗結果與分析

2.1 超氧化物歧化酶活性

超氧化物歧化酶(SOD)是一類金屬酶,廣泛存在于生物體內，可以特異性地催化超氧陰離子的歧化反應[11]。

由圖1可知樹舌靈芝和云芝的SOD活性均高于對照，其中云芝的SOD活性最高，達到85.40U/g，高于對照14.5%，樹舌靈芝的SOD活性同樣高于對照10.4%。

圖1 樹舌靈芝、云芝與靈芝的超氧化物歧化酶活性對比 (單位：U/g)

2.2 過氧化氫酶活性

過氧化氫酶(CAT)可以阻止H2O2與細胞中產生的超氧陰離子自由基進一步生成羥自由基，從而防止自由基對細胞的損傷[12]。

由圖2可知實驗材料的樹舌靈芝和云芝的CAT活性均高于對照組材料，酶活性分別為38.63U/g·min，39.67U/g·min，分別高于對照6.4%、9.3%。

圖2 樹舌靈芝、云芝與靈芝的過氧化氫酶活性對比(單位：U·g-1·min-1)

2.3 谷胱甘肽過氧化物酶活性

谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)是Mills等發現一種自由基捕獲劑，具有很典型的抗氧化活性[11]。

由圖3可知，樹舌靈芝和云芝的GPX活性均高于對照組材料，其中樹舌靈芝的GPX活性最高，為56.79U/mL，高于對照11.0%，云芝的GPX活性53.70U/mL，同樣高于對照10.4%。

圖3 樹舌靈芝、云芝與靈芝的谷胱甘肽過氧化物酶活性對比 (單位：U/mL)

3 討論

從圖1可知，三種材料雖在同一培養條件下生長，但不同菌絲生長狀態不同，且根據趙丹等[11]試驗可知隨著培養時間的延長靈芝的SOD活性減退較快,而實驗組的SOD活性均高于對照，這說明野外采摘的樹舌靈芝和云芝具有較強的SOD活性。付欣[6-7，13]等的實驗數據可以看出，樹舌靈芝和云芝相關酶的抗腫瘤活性更大，因此也可以間接證明其所含CAT和GPX活性也相應要高。但是本實驗主要研究的是菌絲體時期的三種酶活性，根究郝俊江[7]等的研究，可以發現不同菌種在不同生長周期的酶活性存在差異，因此本次試驗只能證明菌絲體時期的三種酶活性差異，具體其他生長周期的SOD、CAT、GPX活性還需要進一步研究。

4 結論

本研究首次對大別山區域野生樹舌靈芝和云芝的抗氧化活性進行了研究，結果表明樹舌靈芝和云芝菌絲體的SOD、CAT和GPX酶活性均高于對照靈芝，而云芝的SOD和CAT活性又較之大于樹舌靈芝，這說明大別山區域的野生多孔菌科真菌具有良好的抗氧化活性。然而，本試驗只探究了多孔菌科真菌菌絲體某一生長階段的酶活性差異，但菌絲體不同生長時期其酶活性也存在差異，因此今后可針對菌絲體整個生長周期，甚至子實體階段的抗氧化活性進行研究。