火焰南天竹組培快繁體系的探討

宋帥杰，黃坤，錢如南，劉峰，林立，陳際伸

(1.匯綠園林建設發展有限公司，浙江 寧波 315800； 2.寧波城市職業技術學院 景觀生態學院，浙江 寧波 315502)

火焰南天竹(NandinadomesticaFirepower)屬小檗科南天竹屬常綠灌木[1]，喜溫暖多濕及通風良好的半陰環境，適宜生長在富含腐殖質的沙質壤土上。火焰南天竹植株矮小，莖節較短[2]。待秋季降溫時，葉片由翠綠變為鮮紅，紅葉可持續至翌春，極具觀賞價值，在南方園林中使用較普遍[3]。南天竹在園林中多叢植或孤植于花徑和庭院，也可做地被及色塊植物，是良好的花徑與庭院材料，市場需求量較大；同時，南天竹的根、莖、葉均有藥用價值[4]。扦插、分株為火焰南天竹常用的繁殖方式，但存在繁殖系數低、品種特性易退化、培育周期較長等缺陷[5]。近年來，隨著火焰南天竹廣泛應用于城市及鄉鎮的園林綠化建設中，觀賞苗木的需求日益增多，傳統的火焰南天竹的繁殖方法已無法滿足市場需求[6]。運用組織培養技術進行火焰南天竹繁殖的研究日益增多。根據現有的火焰南天竹組培快繁技術，外植體萌芽率約為30%～50%，生根率不足50%，增殖系數約1～3，且存活率較低，難以滿足大規模栽培及工業化生產的需求[7]。為此，通過對比不同滅菌時間、培養基和激素濃度及移栽基質等方面的研究，旨在探索出一套外植體萌芽率高、增殖系數大、生根率高的火焰南天竹快繁技術，為火焰南天竹的產業化的發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 外植體

火焰南天竹購自嘉興中瑞生物科技有限公司，4月初選取株高約40 cm的長勢健壯均勻的實生苗，剪取1～2 cm的莖尖作為組培外植體材料。

1.2 培養基

配置MS、1/2 MS、WPM和B5等基本培養基，并添加不同種類和濃度的外源激素，以及30 g·L-1蔗糖和0.7%瓊脂，pH值為5.8，經121 ℃高溫滅菌20 min后待用。

1.3 試驗方法

1.3.1 滅菌時間對成活率的影響

將生長健壯、無病害的火焰南天竹采回后用肥皂水浸泡5 min，然后用流動水沖洗30 min，切取1～2 cm的莖尖進行滅菌處理。在無菌環境下，先用70%酒精消毒5 s，再用10% NaClO滅菌，分別設定5、8、10、12、15、20 min的滅菌時間，然后用無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干水分，切取莖尖部分約2 mm，接種到培養基中。7 d后統計其污染率、成活率及死亡率等。

1.3.2 不同培養基和外源激素對不定芽誘導率的影響

采用MS，1/2MS，WPM和B5為基本培養基，外源激素為6-BA(0.5、1.0和1.5 mg·L-1)、NAA(0.1、0.2和0.5 mg·L-1)和IBA(0.1 mg·L-1)，活性炭(AC)1.0 g·L-1，其他條件為蔗糖30 g·L-1，瓊脂粉6.0 g·L-1，pH值5.8。將滅菌處理后的火焰南天竹莖尖迅速接入誘導培養基中，每處理10瓶，每瓶接6個，30 d后統計誘導率。

1.3.3 不同外源激素和活性炭對不定芽增殖率的影響

繼代增殖培養時，以誘導培養的新芽莖段為材料，以MS為基本培養基，蔗糖30 g·L-1，添加不同濃度的6-BA(0.5和1.0 mg·L-1)和NAA(0.1、0.2和0.5 mg·L-1)，并添加IAA 0.1 mg·L-1和活性炭1.0 g·L-1，每處理重復3次，每重復50瓶，每瓶接種7個新芽，繼代培養3次后統計數據。

1.3.4 IBA濃度和活性炭對生根率的影響

生根培養時，以高2 cm的繼代增殖苗為試驗材料，以1/2 MS為基本培養基，蔗糖30 g·L-1，分別添加IBA(0.5、1.0和1.5 mg·L-1)和活性炭(1.0、2.0、4.0和8.0 g·L-1)，每處理重復3次，每重復30瓶，每瓶接種10個。

1.3.5 基質對組培苗移栽成活率的影響

選取長勢一致的試管苗，將其置于自然光條件下培養3～4 d后打開瓶蓋，煉苗7 d后將幼苗取出，洗盡表面瓊脂，除去較長的根及部分葉片，移入泥炭土∶蛭石∶珍珠巖配置比例分別為2∶2∶1、3∶1∶1、8∶1∶1的不同營養土中。另一個基質全部由泥炭土組成，蓋上薄膜進行保溫保濕培養。每日觀察、記錄移栽苗的生長狀況，培養30 d后統計成活率。

1.4 數據統計與分析

用Excel 2007和SPSS 22.0軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌時間對成活率的影響

研究6個滅菌時間對火焰南天竹莖尖成活率的影響。由表1可知，經10%的NaClO處理外植體5 min，火焰南天竹外植體的死亡率最低，僅為12%，但其污染率最高，達72%；處理20 min后，外植體死亡率高達50%，而污染率為15%；經NaClO處理12 min的火焰南天竹的外植體死亡率為14%，污染率為23%，有效成活率最高，可達63%，效果最佳。

表1 不同滅菌時間對火焰南天竹成活率的影響

2.2 不同培養基和外源激素對不定芽誘導的影響

由表2可知，4種培養基上火焰南天竹的莖芽均有萌發和生長。從誘導率可以看出，不同培養基對火焰南天竹外植體誘導的影響差異顯著。以MS為基本培養基的火焰南天竹的不定芽誘導率達到58%，顯著高于其他培養基。由此可知，MS培養基較適合火焰南天竹外植體的誘導培養。

表2 不同培養基對不定芽誘導的影響

據初代培養基初選的結果，選擇MS為基本培養基，并對6-BA和NAA濃度進行了調整，篩選最適誘導率配方。由表3可以看出，6-BA、NAA和IBA的不同配比均可誘導火焰南天竹的莖段萌發，但誘導率差別較大。其中，6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+AC 1.0 g·L-1的誘導率最高，達87%，顯著高于其他處理。當6-BA達到1.5 mg·L-1時，不定芽分化率反而降低，說明6-BA濃度不是越高越好。6-BA 1.0 mg·L-1時，低濃度NAA能誘導不定芽分化，但NAA 0.5 mg·L-1時，芽分化受到抑制。因此，火焰南天竹莖段誘導不定芽最佳激素濃度配比為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1。7 d后其不定芽生長點開始變綠，長出綠色新葉，1個月后可觀察到火焰南天竹的叢生苗。

2.3 不同濃度外源激素對不定芽增殖的影響

MS培養基中添加適量的活性炭能促進火焰南天竹不定芽的生長和發育。由表4可知，不同外源激素及濃度下，火焰南天竹的增殖表現不同。低濃度的6-BA不利于叢生芽的增殖，高濃度的NAA易形成愈傷組織，但形成的叢生芽生長緩慢，且莖段難伸長。添加適宜的IAA和活性炭有利于其增殖。由此可知，MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1+AC 1.0 g·L-1是火焰南天竹不定芽增殖的最佳組合，增殖系數最高可達5.29。

表3 不同濃度外源激素對不定芽誘導的影響

表4 不同濃度外源激素對不定芽增殖的影響

2.4 不同IBA濃度和活性炭對火焰南天竹生根率的影響

表5表明，火焰南天竹組培苗生根率較高，最高可達98%。每個組培苗平均可長出3～5個不定根，且組培苗生長健壯，長勢均勻。一定濃度的IBA和活性炭同時使用可提高組培苗的生根率。不添加IBA和活性炭時，組培苗的生根率較低，最低僅有67%，根系生長緩慢且細小。培養基中加入活性炭可顯著提高生根率，隨著活性炭濃度的增加，生根率呈先增加后減小的趨勢。不加任何激素也能有效促火焰南天竹生根，但根較細且生根所需時間較長。綜上所述，1/2 MS+IBA 0.5 mg·L-1+AC 4.0 g·L-1為火焰南天竹組培苗的最佳生根培養基，其組培苗根系粗壯，愈傷組織較少，煉苗成活率較高。

表5 不同IBA濃度和活性炭對火焰南天竹 生根率的影響

2.5 不同的基質對火焰南天竹組培移栽苗成活率的影響

從表6可以看出，不同基質直接影響組培苗的移栽成活率。煉苗7 d后移栽至混合基質泥炭土∶蛭石∶珍珠巖8∶1∶1上的火焰南天竹組培苗移栽成活率最高，達94%；在全泥炭的基質中組培苗移栽成活率最低。此外，從各試驗組苗高可以看出，泥炭土含量高的基質，其組培苗生長更快，且葉色濃綠，苗更健壯，但全泥炭影響土壤的透氣性和保水性，不利于組培苗生長。

表6 不同基質對火焰南天竹組培苗移栽 成活率的影響

3 討論

火焰南天竹是一種木本植物，而木本植物再生體系的建立不僅周期長，還具有一定難度。滅菌時間是影響火焰南天竹成活率的重要因素，滅菌時間不足會導致外植體污染率升高、成活率較低。本研究結果表明，10%NaClO對火焰南天竹滅菌12 min的效果最佳。另外，不同培養基和外源激素濃度對火焰南天竹不定芽的誘導及增殖具有重要作用。劉中兵等[8]在南天竹初代培養條件研究表明，MS+6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1為南天竹的最佳誘導組合，最高誘導率為74.4%，造成結果差異的原因可能是不同品種的南天竹所需的6-BA不同；鄧玉營等[9]發現，當6-BA濃度達0.8 mg·L-1時，組培苗會出現玻璃化現象。所以，培養基中6-BA濃度不宜太高，這與本文研究結果一致。本研究通過不同外源激素濃度對火焰南天竹不定芽誘導的影響結果表明，不同激素配比對不定芽誘導的結果不同，6-BA濃度并非越高越好，當濃度達到1.5 mg·L-1時，火焰南天竹不定芽分化率反而降低，以MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+AC 1.0 g·L-1組合對火焰南天竹的外植體誘導率最高，可達87%。周志疆等[10]在火焰南天竹組織培養體系建立與優化的研究中表明，火焰南天竹最佳增殖培養基為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，最高增殖系數為3.5；杜永芹等[11]在耐寒彩葉樹種火焰南天竹的快繁技術研究表明，MS +6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1為最佳增殖培養基，最高增值系數為4.12，其增值系數遠低于本研究結果(5.29)，分析原因可能是由于基礎培養基及外源激素不同對后期組培苗的生長有一定影響。王春等[12]對南天竹進行生根試驗表明，添加IBA 0.25 mg·L-1可使南天竹的生根率最高達87.33%。周志疆等[10]以1/2 MS+IBA 0.3 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1為生根培養基，生根率可達97%。本研究通過IBA和活性炭對生根壯苗的影響發現，在1/2 MS基本培養基中添加IBA 0.5 mg·L-1和活性炭4.0 g·L-1，可顯著提高火焰南天竹的生根率，最高可達98%，且根系粗壯。將組培苗移栽至泥炭土∶蛭石∶珍珠巖為8∶1∶1的混合基質中成活率最高，可達94%，組培苗生長較快、生長健壯、長勢均勻且適應性強。生根困難及移栽成活率低是木本組培中比較突出的問題，阻礙了組培快繁技術在生產上的應用與發展[13-14]。在培養基中添加生長素IBA和活性炭可明顯促進火焰南天竹形成完整的再生植株。生長素對植物生長發育起促進作用，而活性炭也對培養基中有害代謝產物起到吸附作用[15]。另外，組培苗的移栽同樣是組培的關鍵環節，直接影響到組培苗的成活和質量。

本研究所構建的一套高效的火焰南天竹組培快繁體系表現出增殖系數高、培育周期短、組培苗抗逆性好、移栽成功率高的優點，接下來在移栽時期、各階段所需用肥種類及配比等方面還需深入研究。