響應面法優化猴頭菇多酚提取工藝

毛榮良，李英迪，曹艷，黃良水，夏其樂*

(1.常山縣豪鋒農業發展有限公司，浙江 常山 324207； 2.浙江省農業科學院食品科學研究所 農業農村部果品采后處理重點實驗室浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，浙江 杭州 310021； 3.常山縣天樂食用菌研究所，浙江 常山 324200)

猴頭菇又稱猴頭蘑、猴頭菌、刺猬菌或花菜菌等，屬齒菌科猴頭屬[1]，其營養豐富，味道鮮美，是一種藥食兩用食用菌，素有“山珍猴頭，海味燕窩”之說[2]。猴頭菇性平、味甘，活性成分主要有多肽類、多糖類、多酚類、萜類、甾醇類等，具有益精補虛、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、提高免疫力等功效，其子實體可以用來治療胃潰瘍，慢性胃炎和其他、消化道相關疾病[3-5]。關于猴頭菇活性成分的研究中，多糖的研究頗多[6]，其他活性物質研究相對較少。酚類物質是主要存在于植物中的次生代謝產物[7]，猴頭菇中酚類物質大多以活性酚羥基的形式存在，具有較強的抗氧化活性，可以作為天然的抗氧化劑，也可以經過提取富集后進一步發揮其活性。采用乙醇溶液提取猴頭菇中醇溶性小分子成分，如多酚、黃酮等的研究相對較少[8]。本研究以猴頭菇為原料，利用響應面法優化猴頭菇多酚提取工藝，為獲得高品質的猴頭菇酚類提取物及下游抗氧化產品的開發提供可靠的手段和一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

猴頭菇，采自常山縣森力家庭農場；沒食子酸標準品，購自上海源葉；福林酚，上海藍季；乙醇為分析純。

紫外/可見分光光度儀UV-1800，日本島津公司；飛鴿低速大容量離心機LXJ-HB，上海安亭科學儀器廠；多功能粉碎機BJ-300，德清拜杰電器有限公司。

1.2 原料預處理

將猴頭菇干制品粉碎機粉碎，密封后置于4 ℃冷藏，備用。

1.3 猴頭菇多酚含量測定

1.3.1 標準曲線的繪制

多酚含量采用Folin-Ciocalteu法進行測定[9]。分別吸取0.1 mg·mL-1沒食子酸標準品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL，置于25 mL比色管中，加入2.5 mL福林酚顯色劑，混勻后加入5 mL 5% Na2CO3溶液，加水定容至25 mL，25 ℃下避光反應1 h，于750 nm處測定吸光度。以沒食子酸標準品濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制多酚含量標準曲線，并得線性回歸方程。

1.3.2 多酚提取液的制備

在前期預試驗的基礎上，為優化提取工藝，選擇不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30 g∶mL)、乙醇濃度(40%、60%、80%)、提取溫度(40、60、80 ℃)進行提取工藝的優化。所得提取液4 000 r·min-1，離心10 min，收集上清液，即猴頭菇多酚提取液。

1.3.3 多酚得率的測定

取0.3 mL提取液，加9 mL蒸餾水混勻，加入2.5 mL福林酚顯色劑，其余試驗操作同標準品測定，于750 nm處測定吸光值，根據標曲方程計算樣品多酚含量。計算多酚得率：

M=100CNV/m。

式中，M為猴頭菇多酚得率(mg·g-1)；C為沒食子酸濃度(mg·mL-1)；V為提取液的總體積(mL)；N為稀釋倍數；m為猴頭菇質量(g)。

1.3.4 響應面法優化猴頭菇多酚的提取工藝

采用Design Expert 10.0.3軟件進行三因素三水平試驗，確定超聲輔助提取猴頭菇多酚的最佳工藝參數，中心組合試驗因素和水平分別為乙醇濃度為40%、60%、80%，溫度為40 ℃、60 ℃、80 ℃，料液比為1∶10、1∶20、1∶30 (g∶mL)。

1.4 數據分析

平行試驗3次，結果以均值±標準差(means±SD)表示。使用Excel 2007繪圖，采用Design expert 10.0.3軟件得到響應面圖。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

根據1.3.1標曲測定方法，分別以沒食子酸標準品質量濃度為橫坐標，750 nm處吸光值為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程為Y=0.088 8X-0.001 9，R2=0.999 6。結果表明，多酚含量在0～7 mg·L-1范圍內線性關系良好。

2.2 響應面優化條件

2.2.1 響應面設計結果分析

為確定最優條件，探究各因素之間的相互作用，通過Box-Behnken法設計試驗[10]，以多酚得率為響應值，采用響應面法對猴頭菇干制品的酚類化合物進行提取工藝的優化。與傳統的多因素單變量優化試驗相比，響應曲面法可以研究各因素之間的相互作用，具有試驗次數少、省時省力、精確等優點[11]。

對表1試驗數據進行回歸擬合，得到多酚得率的二次多項回歸模型為：

其中，Y為多酚得率的預測響應值，X1為乙醇濃度(%)的編碼值，X2為溫度(℃)的編碼值，X3為料液比(g∶mL)的編碼值。

表1 猴頭菇酚類提取試驗設計與試驗結果

2.2.2 響應面模型建立及顯著性分析

表2 酚類化合物提取回歸模型方差分析

2.3 酚類化合物提取工藝的響應曲面分析、最佳工藝參數確定

圖1、2、3顯示了不同試驗因素(乙醇濃度、溫度以及液料比)對于猴頭菇酚類化合物提取的影響。從圖可以看出，響應值Y隨試驗因素變化均先增高而后降低，在試驗水平范圍內出現一個最高點，即為多酚得率較高點。由Design expert 10.0.3軟件分析結果可知，猴頭菇酚類化合物超聲波輔助提取的最佳工藝參數為乙醇濃度60.38%，溫度55.46 ℃，料液比1∶15.59(g∶mL)。工藝參數預測的多酚得率為16.799 mg·g-1。為了操作方便，將最佳工藝參數設定為乙醇濃度60%，溫度55 ℃，料液比1∶15(g∶mL)。為檢驗響應面分析法可靠性，3次重復試驗的提取得率為16.701 mg·g-1，與預測值較為接近，表明該模型對猴頭菇酚類化合物的提取工藝參數準確可靠，具有實際應用價值。

圖1 提取溫度與料液比對猴頭菇多酚得率影響的響應曲面圖和等高線圖

圖2 乙醇濃度與料液比對猴頭菇多酚得率影響的響應曲面圖和等高線圖

圖3 乙醇濃度與提取溫度對猴頭菇多酚得率影響的響應曲面圖和等高線圖

3 小結

本研究通過乙醇濃度、提取溫度、料液比3個影響因素對猴頭菇多酚的提取進行研究，通過Box-Behnken試驗設計，最終確定最佳提取工藝條件為乙醇濃度60%，溫度55 ℃，料液比1∶15 (g∶mL)，在此條件下，多酚得率相對較高。驗證試驗顯示，猴頭菇多酚得率為16.701 mg·g-1，與預測值接近，說明響應曲面法建立的模型準確可靠，能合理優化猴頭菇多酚的提取工藝。