基于液相色譜串聯質譜的禽肉中抗病毒藥物多殘留檢測方法

陳國，許秀琴

(寧波市農業科學研究院，浙江 寧波 315101)

病毒感染威脅人類和動物健康。養殖戶為避免病毒感染引發畜禽死亡而造成經濟損失，就將金剛烷胺、金剛乙胺、利巴韋林、嗎啉胍、阿昔洛韋、咪喹莫特、美金剛等抗病毒類藥物摻入飼料中[1-3]。但是，將人類藥物移植獸用，會造成動物中毒、藥物殘留、病毒抑制或變異等不良反應，同時畜禽體內不同程度的藥物殘留也會隨食物鏈遷移而影響人類身體健康。因此，開展禽肉中抗病毒藥物多殘留的液相色譜串聯質譜方法研究，建立準確性好、靈敏度高、快捷簡便的檢測方法尤為重要[4-9]。為此，特開展試驗研究，并總結報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

主要儀器包括：Waters 2695 XevoTMTQ MS液相色譜串聯質譜聯用儀(美國Waters)，Quintix 124電子天平(德國Sartorius)，N-EVAP 112氮吹儀(美國Organomation)，3K15離心機(德國Sigma)，Vortex Genius 3漩渦振蕩器(德國IKA)。

主要試劑包括乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、甲酸(色譜純)，均購于美國Merck公司。

供試藥物標準品包括金剛烷胺、金剛乙胺、阿昔洛韋、咪喹莫特、嗎啉胍、美金剛、利巴韋林，均購于德國Dr公司。

標準儲備液制備：精密稱取10 mg標準品于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成100 μg·mL-1溶液，-18 ℃冰箱中避光保存。

樣品制備：取雞肉樣品進行勻漿，充分混勻，制樣過程中，盡可能防止樣品受到污染或殘留物含量的變化，試樣于-18 ℃冰箱中保存。

1.2 樣品提取與凈化

1.2.1 提取

稱取5 g試樣(精確至0.000 1 g)置于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈-1%(體積分數)甲酸溶液(體積比9∶1)，加蓋后超聲提取10 min，再旋渦混勻3 min，低溫條件下9 000 r·min-1離心10 min，取出上清液，再加入10 mL乙腈-1%甲酸溶液提取液，重復上述步驟，離心后合并上清液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。

1.2.2 凈化

準確移取5 mL上清液，加入100 mg PSA(乙二胺基-N-丙基)和100 mg C18-ODS(十八烷基-硅膠)，渦旋1 min，5 000 r·min-1離心5 min，移取3.0 mL上清液于10 mL離心管中，在40 ℃條件下用氮吹儀吹至近干，然后準確加入1 mL 0.1%(體積分數)甲酸溶液復溶，渦旋1 min，超聲5 min后過膜，試液供液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)測定。

1.3 基質效應試驗

用1.2節處理后的樣品基質溶液將金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、阿昔洛韋、咪喹莫特、嗎啉胍配制成1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100 μg·L-1的系列基質標準工作液，將利巴韋林配制成5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、100 μg·L-1的系列基質標準工作液。同時，用溶劑按前述質量濃度配制系列標準工作液，以系列基質標準工作液和系列標準工作液的曲線斜率比來評價基質效益。

1.4 試驗條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq反相色譜柱，規格100 mm×3.0 mm，粒徑1.8 μm。流動相：A相為0.1%(體積分數)甲酸溶液，B相為甲醇。梯度淋洗，流速0.3 mL·min-1，進樣體積10 μL。程序如下：0 min，流動相A 99%(體積分數，下同)，流動相B 1%；2.5 min，流動相A 99%，流動相B 1%；4.0 min，流動相A 85%，流動相B 15%；7.0 min，流動相A 10%，流動相B 90%；7.1 min，流動相A 99%，流動相B 1%；10.0 min，流動相A 99%，流動相B 1%。

1.4.2 質譜條件

離子源，電噴霧正離子模式(ESI+)；監測模式，多離子反應監測(MRM)；電噴霧電壓(IS)，3 700 V；離子源溫度(TEM)，500 ℃；錐孔反吹氣流量，25 L·h-1；脫溶劑氣流量，1 000 L·h-1。

供試藥物的質譜參數如下。金剛烷胺，保留時間7.91 min，定性離子對152.0/92.7(m/z，下同)，定量離子對152.0/135.1，駐留時間100 min，錐孔電壓32 V，碰撞電壓26 V(定性)、14 V(定量)；金剛乙胺，保留時間8.57 min，定性離子對180.1/121.2，定量離子對180.1/163.3，駐留時間100 min，錐孔電壓32 V，碰撞電壓24 V(定性)、15 V(定量)；美金剛，保留時間8.75 min，定性離子對180.1/106.7，定量離子對180.1/163.3，駐留時間100 min，錐孔電壓32 V，碰撞電壓24 V(定性)、15 V(定量)；阿昔洛韋，保留時間7.10 min，定性離子對226.0/134.7，定量離子對226.0/151.8，駐留時間100 min，錐孔電壓16 V，碰撞電壓26 V(定性)、10 V(定量)；咪喹莫特，保留時間8.60 min，定性離子對241.1/113.7，定量離子對241.1/184.9，駐留時間100 min，錐孔電壓66 V，碰撞電壓54 V(定性)、22 V(定量)；嗎啉胍，保留時間2.68 min，定性離子對172.0/112.7，定量離子對172.0/59.6，駐留時間100 min，錐孔電壓28 V，碰撞電壓16 V(定性)、18 V(定量)；利巴韋林，保留時間2.97 min，定性離子對245.0/95.6，定量離子對245.0/112.6，駐留時間100 min，錐孔電壓18 V，碰撞電壓28 V(定性)、8 V(定量)。

2 結果與分析

2.1 基質效應

通過基質效應試驗，分別擬合7種抗病毒藥物系列基質標準工作液和系列標準工作液的標準曲線(表1)，其決定系數(R2)均大于0.999。金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、咪喹莫特、利巴韋林的基質標準曲線(即由系列基質標準工作液擬合的標準曲線)和溶劑標準曲線(即由系列標準工作液擬合的標準曲線)的斜率比在0.85～0.91，說明基質效應不明顯；而阿昔洛韋、嗎啉胍的基質標準曲線和溶劑標準曲線斜率比分別為0.63、0.45，基質效應明顯。基于此，本試驗實際分析樣品時均采用基質標準曲線進行定量分析。

表1 供試藥物的標準曲線

2.2 檢測限、定量限

開展空白樣品平行試驗，按3倍信噪比計算方法檢出限，按10倍信噪比計算方法定量限(表2)。結果顯示，7種抗病毒藥物的檢出限在2.5×10-4～1.5×10-3mg·kg-1，定量限在0.001～0.005 mg·kg-1。

2.3 準確度和精密度

表2 供試藥物的定量限和檢出限

方法的準確度和精密度分別由添加回收率和變異系數來表示。在雞肉中按要求添加7種供試藥物，每種濃度重復測定6次，計算添加回收率和變異系數，評價方法的準確度和精密度，結果如表3所示。金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、阿昔洛韋、咪喹莫特、嗎啉胍在1.0、5.0、50.0 μg·kg-1的添加水平下，添加回收率在79%～107%；利巴韋林在5.0、10.0、50.0 μg·kg-1的添加水平下，回收率在84%～99%。供試藥物的平行試驗組內和組間變異系數均未超過10%。以上結果表明，該方法具有較好的準確度和精密度。

表3 供試藥物的添加回收率和變異系數(n=6)

2.4 樣品驗證

采用所建立的方法對10個雞肉樣品進行分析，共檢出陽性樣品3個，均系從樣品中檢出金剛烷胺，含量分別為0.021、0.025、0.031 mg·kg-1，其他供試藥物在各樣品中均未檢出。

3 小結與討論

3.1 討論

3.1.1 提取條件優化

7種供試藥物均屬于極性化合物，易溶于水和一些有機溶劑，一般選用有機溶劑-水的混合液進行提取。對比乙腈-水溶液(體積比9∶1)和甲醇-水溶液(體積比9∶1)對目標分析物回收率的影響，發現乙腈-水溶液的提取效果更好。向乙腈-水溶液中添加一定比例的甲酸，對回收率的影響不大，但可起到一定的凈化效果，能夠提高方法靈敏度。因此，綜合選擇乙腈-1%甲酸溶液(體積比9∶1)作為提取液。

3.1.2 凈化方式選擇

QuEChERS方法是由分散固相萃取法演變而來的，樣品經有機溶劑提取、鹽析分層后，再進行分散固相萃取，從而達到凈化目的。本研究采用的PSA和C18-ODS填料，對樣品中的脂肪、蛋白質凈化效果良好，能有效降低基質效應，提高樣品檢測靈敏度。QuEChERS方法相較于固相萃取小柱的凈化方式，更快捷、環保，且成本低廉，有廣闊的應用前景。

3.1.3 色譜條件優化

色譜中常用的有機相有甲醇和乙腈。對比發現，若以甲醇作為有機相，7種供試藥物的響應值均有較大提高。另外，向水相中添加甲酸或乙酸銨也能提高目標化合物的響應值，但是當添加乙酸銨時，金剛乙胺和美金剛的峰形很難分開，而添加0.1%甲酸時，各供試藥物能有效分離，且峰形好。因此，水相采用0.1%甲酸水溶液。

3.2 小結

本方法選擇乙腈-1%甲酸溶液(體積比9∶1)作為提取液，采用QuEChERS方法，建立起LC-MS/MS分析方法，金剛烷胺、金剛乙胺、美金剛、阿昔洛韋、咪喹莫特、嗎啉胍、利巴韋林的檢出限在2.5×10-4～1.5×10-3mg·kg-1，定量限在0.001～0.005 mg·kg-1，回收率在79%～107%，平行試驗組內和組間變異系數均未超過10%。可見，所建立的方法適用于禽肉中抗病毒藥物的多殘留分析。