CHO 細胞大規模培養表達單克隆抗體的工藝研究

張海燕 牛輝 畢利利

華蘭基因工程有限公司 河南新鄉 453000

1 概述

1.1 單克隆抗體介紹

從1975 年 至 今， 單 克 隆 抗 體（monoclon alanti body，mAb）經歷了從簡單的雜交瘤細胞株中表達到使用成熟的動物細胞進行大規模生產的歷程。目前，單克隆抗體可以分為三類，分別是鼠源性單克隆抗體、人源化單克隆抗體和全人源單克隆抗體，其中全人源單克隆抗體也可算作人源化單克隆抗體的一個分類。

1.2 中國倉鼠卵巢細胞

CHO 細胞是指中國倉鼠卵巢細胞，是從中國灰倉鼠卵巢組織經過分離，然后進行連續傳代而得到的哺乳動物細胞。目前CHO細胞是應用最為廣泛的抗體生產動物細胞，據統計目前有超過70%的動物細胞表達產品由CHO 細胞表達和生產，在我國現有的絕大多數生物大分子藥物都是由CHO 細胞表達[1]。

2 大規模培養工藝及可能存在的問題

規模放大策略。細胞培養工藝過程中的參數可以分為兩類：與體積相關的參數和與體積無關的參數。隨著反應器規模大小變化而變化的參數，在放大過程中會根據反應器通氣孔徑的大小和方式，以及攪拌槳的大小和形式而發生變化。一般來說，隨著反應器體積的變大，通氣速率一般呈線性上升的趨勢。通氣流速的放大一般采用單位體積單位時間的通氣量（vvm）恒定的方法。其中，O2和CO2流速的放大方法在實際的操作過程中還要根據反應器中DO 和pH 控制器的類型以及工藝要求的控制策略做適當的調整。在參數放大過程中，反應器攪拌轉速的放大需要考慮的因素比較多。大型反應器的攪拌速度需要考慮既能夠為反應器提供足夠的混合能力，還要避免造成由于高轉速條件下剪切力所引起的不必要的細胞損傷。轉速對體積氧傳遞系數（KLa）的影響，也是在放大過程中需要考慮的一個重要因素[2]。

3 CHO 細胞培養方法

隨著重組蛋白等生物大分子藥物的開發和發展，CHO 細胞的培養工藝研究也不斷地深入。根據培養的方式CHO 細胞培養生產工藝可以分為批次培養（Batch）、補料批次培養（Fed-Batch）、連續培養。連續培養又包括濃縮補料培養（ConcentratedFedbatch）和灌流（注）培養（Perfusion）等。在細胞培養工藝開發中，需要根據各個項目的不同特點，如宿主細胞的性質、宿主細胞在培養環境中能夠維持的培養周、細胞表達產品的穩定性等方面綜合評估后選擇合適的培養方式。

3.1 批培養方式的應用

批培養方式相比其他培養方式，因為在培養過程中不需要進行補加營養物的操作，所以在生產過程中需要的操作少，減少了培養過程中微生物污染的風險。另一方面由于不進行補料操作，培養環境中的營養物的含量在培養開始時已經確定，隨著細胞的生長營養物不斷減少，代謝產物持續升高，所以生產周期相對較短，對于宿主細胞本身不能維持長期生長、細胞表達產品在培養液中容易產生降解、聚集等質量變化的項目更為適合。

3.2 補料批培養方式的應用

由于批培養過程中隨著細胞生長，培養液中的營養物持續下降，代謝產物持續增加，限制了細胞培養的周期，進一步限制了目的蛋白的表達量。隨著細胞生長而逐漸降低的營養物，為細胞的生長提供所需營養。所以相比于不補料的批培養方式，補料批培養一般能得到更高的細胞密度，更長的細胞培養周期，更高的蛋白表達量。補料批培養方式也是目前應用最多，技術發展最完善的培養方式。雖然補料批培養方式能向培養體系中補充已經消耗的營養物，為細胞生長持續提供營養，但隨著細胞密度的增加，細胞消耗越來越多的營養同時代謝出越來越多的代謝廢物，而這些代謝廢物無法從培養環境中被分離，最終仍然會導致細胞活率的下降，細胞培養周期一般也較為固定，目前多數的補料批培養工藝的周期約12-18 天。

3.3 連續培養

由于補料批培養方式只能向培養體系中補充營養物，無法將細胞代謝產生的副產物從培養環境中去除，所以細胞在培養到一定時間后仍然會出現細胞活率下降的現象。所以在細胞培養工藝的不斷幾步中，發展出了濃縮補料培養和灌注培養兩種培養模式，這兩種新的培養模式都能很好的解決了培養環境中細胞代謝廢物對細胞的副作用。

濃縮補料培養法由于不能將目的蛋白從培養液中分離，所以在培養過程中，目的蛋白的濃度在不斷升高，對于那些在培養液中不穩定的目的蛋白并不適用。而灌注培養法在培養的過程中不斷地將目的蛋白從培養液中分離，而只把細胞截留在培養液中，所以目的蛋白在從細胞內被表達到胞外后，即可在較短的時間內進入到純化環節，可以將目的蛋白與宿主細胞自身表達的酶分離。

4 培養基

本研究采用的培養基均為目前應用廣泛的商業化培養基，配方如表1。

表1 培養基配方

5 結語

隨著醫藥行業的不斷發展，生物醫學越來越受到人們的關注，作為生物醫學的重要組成部分，單克隆抗體在CHO 細胞中的大規模培養和表達技術越來越多。通過對其CHO 細胞培養的培養基優化、培養參數分析及工藝的放大等研究分析來實現CHO 細胞大規模培養表達單克隆抗體生產工藝的穩定性，進而推動單克隆抗體產業在醫藥領域的不斷向前發展。