植物對河濱人工護坡基質上生物膜酶活的影響

趙靜巖，吳繼業，王強強，葛利云，葉盛，彭路菊，鮑根蓮，鐘銘晨，鄧歡歡

(1.溫州醫科大學 公共衛生與管理學院，浙江 溫州 325035； 2.浙南水科學研究院，浙江 溫州 325035； 3.上海海庭環境工程有限公司，上海 200092； 4.溫州醫科大學 檢驗醫學院生命科學學院，浙江 溫州 325035； 5.龍灣區環境監測站，浙江 溫州 325035； 6.浙江中藍環境科技有限公司，浙江 溫州 325035)

生物膜是由自養微生物(藻類等)或異養微生物(病毒、細菌、真菌、原生動物等)構成的聚合體，它聚集在固-液交界處，并包裹于含水量較高的胞外聚合物中[1-2]。張亮等[3-4]的研究顯示，土壤微生物是土壤酶的主要來源，土壤酶活性與土壤微生物種群結構和數量密切相關，我們有理由認為，生物膜的酶活性也主要來源于其自身的微生物。這些微生物具有的磷酸酶、脲酶和脫氫酶活性可以將水體中的污染性有機物分解為無機物，因此，其酶活性大小可以從一定程度上指示水體的自凈能力。本文針對種植植物對基質上生物膜酶活的影響進行了深入研究，試驗以上方種植再力花的新型人工基質M為試驗組，未種植再力花的新型人工基質N為對照組，研究兩組基質表面生物膜酶活的差異[5]，探討在基質上種植再力花是否有利于填料的污水凈化能力，為提高河道自凈能力提供理論依據和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 新型人工基質

引入的新型人工基質是聚氯乙烯或聚丙烯經亂絲熱熔相互搭接，再經模具擠壓成型的三維網狀材料(圖1)，試驗所用基質的規格均為100 cm×30 cm×100 cm。

圖1 新型人工基質

1.1.2 植物材料

再力花(ThaliadealbataFraser)為竹芋科多年生挺水草本植物。

1.1.3 主要試劑

甲苯、0.5%磷酸苯二鈉溶液、0.3%鋁鉀礬溶液、硼酸緩沖液、氯代溴苯醌亞胺試劑、磷酸緩沖液、10%尿素溶液、1 mol·L-1KCl溶液、25%酒石酸鉀鈉、納氏試劑、Tris-HCl緩沖液、0.1 mol·L-1葡萄糖溶液、0.5% TTC、濃硫酸、蒸餾水等。

1.1.4 主要儀器設備

pH計、離心機、分析天平、振蕩培養箱、立式蒸汽壓力滅菌鍋、超聲波清洗機、恒溫干燥箱、恒溫水浴鍋、紫外-可見分光光度計(SHIMADZU，UV2450)、熒光分光光度計(HITACHI，F4500)、便攜式多參數水質分析儀(美國金泉，YSI556MPS)、自動酶標儀(美國Thermo，Multiskan MK3)、流動注射分析儀(德國Bran Luebbe，AA3)、隔水式培養箱、雙目倒置式生物顯微鏡、酶標檢測儀等[6-7]。

1.2 方法

1.2.1 處理設計

以溫州某大學校內河為試驗河流選段，比較分析再力花在不同季節(5、8、11、1月)對新型人工基質上生物膜磷酸酶、脲酶和脫氫酶活性的影響。在同一河段內放置新型人工基質M(上方種植再力花)和新型人工基質N(未種植再力花)，基質上表面與水面齊平(試驗時基質已放置約15個月)。

1.2.2 樣品采集與處理

取樣方式如圖2所示。分別在M、N基質的20和50 cm處截取兩塊規格約為10 cm×30 cm×10 cm的小塊基質，記為M20、M50和N20、N50。將小塊基質放入500 mL燒杯中，用蒸餾水洗去其表面附著的非生物雜質后，再加入約300 mL蒸餾水，用物理法使表面生物膜剝落。超聲處理15 min后(超聲頻率50 Hz)，將溶液轉移到1 000 mL錐形瓶中，加入適量微型玻璃珠，室溫下充分震蕩15 min得到均勻的生物膜混合液，作為后續試驗樣品備用。

圖2 取樣方式

1.2.3 生物膜干重測定

1.2.4 磷酸酶活性測定

基質磷酸酶活性的測定采用磷酸苯二鈉法[9]，以1 g生物膜24 h釋放出酚的量表示酶活性。

1.2.5 脲酶活性測定

基質脲酶活性的測定采用奈氏比色法[9]，以1 g生物膜每48 h釋放出氨的量表示酶活性。

1.2.6 脫氫酶活性測定

基質脫氫酶活性測定采用TTC-脫氫酶測定法[10]，以1 g生物膜每小時產生1 μg三苯基甲臜(TF)的量作為1個酶活力單位。

1.2.7 數據處理

采用Origin Pro 9.1軟件和AutoCAD 2012軟件進行數據統計分析和圖表制作。

2 結果與分析

2.1 同水平面上M、N基質生物膜干重的對比

生物膜干重反映的是生物膜總量，是生物膜參數中最為常用的指標。研究表明，種植不同植物和不同入水深度的基質上的微生物群落具有不同的群落結構和代謝特性[11]。如圖3所示，春、冬兩季基質表面生物膜干重均為種植再力花組高于不種植再力花組，即M50>N50，其中冬季種植再力花的新型人工基質表面生物膜干重約為未種植植物再力花基質表面干重的2倍。秋、冬季節基質表面的生物膜干重均呈現N20較M20高，究其原因可能是再力花枝葉較大，遮擋了日光對水面下基質的照射，而生物膜的厚度和干重與入射光強相關，導致種植再力花的M組基質表面生物量略低于N組。黨楠[12]的研究也證實了這一觀點。一年四季總體上表現為冬季生物膜干重最高。

a和b表示同一季節的M組和N組數據有顯著差異，圖4～6同。圖3 不同季節M、N基質生物膜干重的變化

2.2 同一水平面上M、N基質生物膜酶活性的對比

2.2.1 磷酸酶活性變化

本試驗測定的磷酸酶是一種能將對應底物去磷酸化的堿性磷酸酶，即可通過水解磷酸單酯將底物分子的磷酸基團除去，并生成磷酸根離子和羥基自由基[5,13-14]。如圖4所示，除春季外，種植植物比未種植植物的新型人工基質表面的磷酸酶活性均有明顯增高，即M>N，這與李宏[15]的研究結果一致。其中，夏季M20與N20的差值最大，其M、N組樣本基質的磷酸酶活性差異表現為20 cm處比50 cm處更加明顯，原因是淺位點受陽光直射效果較好，溫度和濕度等環境條件可使堿性磷酸酶的酶活性保持在較高水平。

圖4 不同季節M、N基質生物膜磷酸酶活性變化

2.2.2 脲酶活性變化

脲酶的主要作用是將水中的有機物質催化分解為氨態氮，植物可吸收利用這些含氮無機鹽，并且其代謝產物能夠促進根際微生物生長，刺激脲酶的合成及活性增強[5,16-17]。

如圖5所示，基質表面脲酶活性總體上呈現M50>N50；在夏季，M20顯著高于N20；冬季基質表面的脲酶活性整體上處于較低水平，且種植植物的M組基質酶活反而下降。姚健等[18]研究證明，土壤酶活性隨季節變化有明顯的規律，不同類酶的變化有些許差別，但總體上表現為冬季酶活性最低，春季上升，夏秋季活性較高。由此推測水體中基質表面生物膜酶活性也有相似特點，冬季低溫會抑制脲酶的活性，再加上冬季再力花枯萎，根系無法起到促進脲酶活性的作用。除個別情況M組相對N組的脲酶活性有小幅下降外，總體上均呈現種植植物的M組基質表面脲酶活性明顯高于不種植植物的N組。

圖5 不同季節M、N基質生物膜脲酶活性變化

2.2.3 脫氫酶活性變化

脫氫酶屬氧化還原酶類,能酶促有機物質脫氫，起著氫的中間轉化傳遞作用，因此，脫氫酶活性可作為微生物氧化還原系統的指標，反映處理體系內活性微生物的量及其對有機物的降解活性，以評價降解性能[19-21]。本試驗脫氫酶測定采用TTC法，該法主要選用無色的氯化三苯基四氮唑(TTC)作為人為受氫體，受氫后生成深淺不同的紅色TF，TF顏色越深，說明脫氫酶活性越高。

如圖6所示，春、夏、秋三個季節在20、50 cm兩個水平面取樣的新型人工基質表面脫氫酶活性均表現為種植植物的一組高于未種植植物的對照組，即M>N；秋季種植物的M基質顯著高于未種植物的N基質。李今[22]的研究表明，基質脫氫酶活性空間分布規律與生物膜生物量的積累趨勢有一致性。但本研究結果顯示，在冬季基質表面生物膜干重最大，整體脫氫酶活性卻偏低，究其原因可能是1月氣溫較低，抑制了脫氫酶的活性[20,23](生物膜脫氫酶活性的適宜溫度為38 ℃)。

圖6 各季節同一水平面上M、N基質生物膜 脫氫酶活性變化

3 小結

本研究對同一河段中種植再力花的新型人工基質和未種植再力花的新型人工基質上生物膜的磷酸酶、脲酶和脫氫酶活性以及微生物總量進行測定。結果表明，微生物量總體上表現為種植植物的新型人工基質高于未種植植物的新型人工基質，且冬季生物量最大，春季最少；四個季節的磷酸酶、脲酶、脫氫酶活性均是在種植植物的較高，且植物對磷酸酶和脲酶活性的促進作用在夏季較為顯著，對脫氫酶活性的促進作用在秋季較為顯著。在新型人工基質上種植植物可為微生物生長繁殖提供更多的養料和更合適的生存環境，從而增加微生物數量，也使其酶活增強。結果表明，在基質上種植植物可通過提高基質上生物膜的酶活，從而增強河道的自凈能力，改善水體微環境。本試驗的研究內容是城市濱水岸帶新型人工基質修復技術研究的一部分，放置種植植物的新型人工基質能很好地避免河流生態作用降低、水質惡化、生境喪失或被阻斷、物種減少等河流生態系統退化問題。

本研究著重從保護水的自然清潔和維持人與水環境和諧的角度去考慮問題，經過優化設計，開發合適的近自然濱水岸帶建設技術，重新構建生態位功能較為完善的城市內河濱水岸帶結構，對于城市河流水質穩定好轉，重建自然生態景觀和促進水生生態物種復育，具有多方面的重要意義。