關于大豆發芽過程中抗原蛋白的變化研究

毛 悅 聶振昌 唐香山

（唐人神集團股份有限公司，株洲412000）

大豆作為飼料中主要的植物型蛋白來源，其蛋白含量較高， 對于生長豬而言， 其消化率也較高， 大部分氨基酸的消化率介于80%-90%之間。 但是這些指標主要是對于生長豬而言，大豆中也存在較多的抗營養因子， 由于早期仔豬的胃腸道發育不完善， 對植物型蛋白源消化能力較差， 有研究表明大豆中的抗營養因子會引起仔豬腸道消化膜損傷， 尤其部分抗原蛋白即使經過熱處理也會造成腸道炎癥。 但是大豆經過發芽處理后， 種子內部的淀粉、 脂肪以及蛋白質會逐步分解， 限制性氨基酸等物質的含量也有所提高， 風味得到改善。 本實驗主要觀察大豆抗原蛋白的變化， 以利用發芽大豆作為仔豬植物型蛋白來源提供理論依據。

1.材料與方法

1.1 試驗材料

大豆： 地方品種株洲市超市購買； 該實驗所需試劑丙烯酰胺、 Beta-巰基乙醇、 過硫酸銨等均為分析純試劑。

1.2 試劑與儀器

康麗CN-A323B 大豆發芽機、 101-2AB 電熱鼓風干燥箱箱、 FW-100 手提粉碎機、 AL204型分析天平、 六一蛋白電泳系統。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆樣品制備

挑選優質黃大豆， 清洗， 浸泡， 在發芽機內加入足夠的水， 室溫下發芽， 每天澆水一次并取一定量的發芽大豆樣品， 實驗期維持6 天，樣品選取發芽第0、 1、 2、 3、 4、 5、 6 天的黃豆， 整株在烘箱內55℃烘干， 手提粉碎機粉碎備用。

1.3.2 SDS-page 試驗試劑配制

①樣品浸提液： Tris 3.63 g， Beta-巰基乙醇0.7 ml 定容至1L， 用HCL （HCL： H2O=1:1）調節PH 為8.0。 ②30%丙烯酰胺： 丙烯酰胺30 g，雙丙烯酰胺0.8 g， 去離子水定容至100 ml。 ③4×堆 積 膠 緩 沖 液： 1 mol/L Tris-HCL （PH=6.8） 50 ml， 10% SDS 4 ml， 蒸 餾 水46 ml，10%過硫酸銨5 ml。 ④電泳緩沖液： Tris 3 g，甘氨酸 14.4 g， SDS 1 g， 定容至1 L， 調節PH 至8.3。 ⑤5×樣品緩沖液： 1 mol/L Tris-HCL(PH=6.8) 0.6 ml， 50%甘油 5 ml， 10% SDS 2 ml， Beta-巰基乙醇0.5 ml， 1%溴酚藍1 ml，蒸餾水0.9 ml。 ⑥染色液： 考馬斯亮藍0.25 g，甲 醇45.4 ml， 冰 醋 酸9.2 ml， 去 離 子 水45.4 ml。 ⑦脫 色 液： 甲 醇114 ml， 冰 醋 酸18 ml，去離子水118 ml。

表1 濃縮膠和分離膠配方

1.3.3 SDS-page 電泳

取不同天數的發芽大豆烘干樣1 g， 加入20 ml 提取液， 室溫條件下浸泡1 h， 每隔10 min充分混勻， 之后8000 rpm 離心20 min， 取上清液20 μl， 加入40 μl 上樣緩沖液， 沸水浴3 min后8000 rpm 離心5 min。

取樣品處理后上清液上樣， 濃縮膠跑電泳時電壓穩定保持80 V， 分離膠的電壓調為120 V。電泳結束后， 小心切去濃縮膠， 放入新鮮染色液染色45 min， 用自來水漂去剩余染液， 直至水流無色， 之后倒入脫色液脫色， 每隔2 h 換一次脫色液， 直至蛋白條帶清晰可見。

2.結果與分析

2.1 SDS-page 凝膠電泳結果

如圖1 中標識所示α、 α’、 β 是未發芽大豆中大豆抗原蛋白7 S 的三個亞基， A1、 A2、 A3、A4、 Basic 是大豆抗原蛋白11S 的五個亞基。

將大豆發芽的跑膠圖導入Photoshop 中將圖像全部轉換為8 位灰度進行處理， 之后導入GelAnalyzer2010a 進行前處理， 對應對照抗原蛋白特定區域選取所需泳道以及所需條帶， 得出峰面積結果， 該區域峰面積較大則該條帶蛋白含量高。

表2 各亞基占大豆抗原蛋白總量的比例

圖1 大豆發芽抗原蛋白SDS-page 跑膠結果圖

圖2 GelAnalyzer 特征抗原條帶峰面積圖

圖3 GelAnalyzer 處理條帶峰面積處理結果

從SDS-page 凝膠電泳整體情況分析， 如圖3 所示大豆發芽第1 天至第6 天蛋白條帶都出現明顯降解， 隨著時間的推移， 大分子蛋白條帶逐漸變淺， 同時小分子蛋白條帶逐漸增多， 大豆發芽時酶的活化最為明顯， 隨著發芽時間的延長， 在蛋白酶的作用下， 蛋白質含量組成不斷發生變化， 大分子蛋白含量隨發芽時間的延長逐漸降低， 小分子蛋白含量則有所增加， 發芽期間發生了蛋白質、 氨基酸種類的變化。

根據峰面積處理結果圖， α 處發芽1-5 天蛋白含量處于下降， 第6 天變化不明顯， α’ 處隨著時間推移慢慢變淺； β 處1-3 天變化緩慢，第3-5 天變化明顯， A3 處均逐步變淺； A1、A2、 A4 處1-3 天變化緩慢， 第3 天-第4 天變化明顯， 4-6 天變化不明顯。 因此對于整體發芽情況， 7S、 11S 抗原蛋白均有所下降， 下降趨勢基本一致。

大豆發芽過程是一個大分子蛋白不斷降解成小分子蛋白的過程， 隨著時間的推移， 新的蛋白質不斷形成， 大豆內源蛋白酶的種類隨著時間的變化而發生了一系列的變化， 由文獻了解到發芽1-4 天， 蛋白酶以切割大分子蛋白的內切酶為主， 此時SDS-PAGE 電泳圖中大分子量的蛋白條帶逐漸變淡， 小分子量的蛋白條帶不斷形成； 發芽4-6 天， 蛋白酶主要作用于一些分子量較小的蛋白， 這一時期大分子蛋白條帶被繼續分解至完全消失， 小分子蛋白條帶清晰形成， 結果基本一致。

3.總結

本實驗通過大豆發芽處理， 檢測其大豆抗原蛋白含量的變化。 上述結果表明， 發芽后5天其大豆抗原蛋白有了明顯的降解， 考慮到大豆發芽時間過長， 一般在6-7 天會開始腐敗，根據上述結果與后續生產效率的要求， 建議大豆在第5 天終止發芽。

參考文獻 （略）