葉酸缺乏可能誘導小鼠胚胎干細胞自噬的發生

董小歡 吳建新

隨著國內人民生活水平的提高以及二胎政策的放開，補充葉酸等優生優育措施被越來越多的民眾所重視。葉酸是水溶性維生素B9，作為一碳單位的載體，主要參與DNA 合成和DNA甲基化這兩個重要的生物化學過程[1]。葉酸缺乏在發育異常、衰老、腫瘤等各種疾病中發揮著重要作用，可誘導細胞死亡[2]。本團隊前期研究發現葉酸缺乏可誘導小鼠胚胎干細胞(mESCs)發生凋亡[3]。細胞自噬是細胞死亡的一種類型，但是葉酸缺乏和自噬關系尚未明確。因此，本研究選取mESCs為研究模型，探索葉酸缺乏是否可能誘發自噬。

資料與方法

1.材料：小鼠胚胎干細胞由本實驗室凍存；葉酸粉末購自Sigma公司；DMEM高糖培養基(含葉酸)、胎牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸鈉、DPBS(無鈣鎂)、L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素、2-巰基乙醇、胰酶替代品均購自GIBCO公司；重組小鼠白血病抑制因子購自Millipore公司；DMEM高糖培養基(不含葉酸)購自北京思賽因公司；明膠購自Amresco公司；哺乳動物蛋白提取試劑盒、總RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自北京康為世紀公司；cDNA逆轉錄試劑盒購自Promega公司；LC3和β-actin抗體均購自Cell Signal Technology公司。

2.mESCs常規培養和分組：胚胎干細胞完全培養基(正常對照組,Control)包括DMEM高糖培養基(葡萄糖含量4 500 mg/L、葉酸含量4 mg)、15%胎牛血清、L-谷氨酰胺2 mmol/L、青霉素/鏈霉素100 U/L、2-巰基乙醇0.1 mmol/L、非必需氨基酸0.1 mmol/L、丙酮酸鈉1 mmol/L、重組小鼠白血病抑制因子1 000 U/L。葉酸缺乏組(FD)完全培養基為DMEM高糖培養基(不含葉酸)中添加葉酸2 mg，其余成分同正常對照組，且細胞培養條件不變。在0.2%明膠包被培養板，將液氮中凍存的mESCs取出進行復蘇后，置于明膠上，加入正常對照組培養基，于37℃，5% CO2飽和濕度的培養箱中培養，每24 h更換正常對照組完全培養基將細胞培養至48 h進行傳代，收集細胞離心去上清后，往細胞沉淀中加入FD組的完全培養基吹打混勻至單細胞狀態，將等量細胞分別加入Control組和FD組的完全培養基中繼續培養，每24 h更換兩組細胞各自的完全培養基。分別在培養12 h、24 h、36 h、48 h這4個時間點收集Control組和FD組的細胞，離心去上清后保留細胞沉淀用于后續實驗。

3.熒光實時定量PCR法檢測LC3B和Foxo3的表達：分別在4個時間點(12 h，24 h，36 h，48 h)下，收獲培養的兩組細胞(Control組和FD組)，根據試劑盒步驟分別提取兩組細胞的總RNA，Nanodro P1000分光光度計測總RNA濃度；Promega反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，反轉錄條件為42 ℃ 15 min，95 ℃ 5 min，0～5 ℃ 5 min；然后根據Fast SYBR Mixture試劑盒步驟進行real time PCR反應，體系為25 μl；LC3引物序列為F:5′-CCAGTGATTATAGAGCGATAC-3′,R:5′-AGGAAGAAGGCTTGGTTAG-3；Pik3r1引物序列為F:5′-CATTGACAGTAGGAGGAGGTTGGAA-3′，R:5′- TTTCTGCGTCAGCCACATCAAGTAT-3′；Pik3r3引物序列為F:5′- TCACAAATGGAATGAAGGACAG-3′，R:5′-AGGCATCACGAACTAAGAAGGT-3′；Akt1引物序列為F:5′-ACTCATTCCAGACCCACGACC-3′，R:5′-CAGACACAATCTCCGCACCAT-3′；內參β-actin引物序列為F:5′-TTCCAGCCTTCCTTCTTG-3′，R:5′-GGAGCCAGAGCAGTAATC-3′；擴增條件為95℃ 20 s預變性，95℃ 3 s，60℃ 30 s，40個循環，每份樣品做3個復孔；基因表達變化均采用2- △△ Ct相對定量分析法。以β-actin為內參基因，熒光實時定量PCR法檢測兩組細胞中LC3B和Foxo3的表達，檢測三者在mRNA水平的表達量[4-5]。

4.免疫印記實驗檢測LC3B的表達：根據試劑盒步驟分別裂解兩組細胞，提取總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度，40 g蛋白樣品以15%SDS-PAGE膠分離后每份樣品做3個復孔，通過濕轉法轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫搖床封閉1 h，分別加兔抗LC3單克隆抗體(1:1 000)、兔抗Actin單克隆抗體(1:1 000)過夜；TBST洗膜3次，10 分鐘/次，然后與HRP標記的山羊抗兔二抗(1:2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，10 分鐘/次，增強型 ECL化學發光成像，X膠片曝光顯影，掃描為照片，最后利用Quantity One軟件對條帶行分析。

5.統計學處理：應用Excel 2007統計軟件包處理數據，計量資料采用均數±標準差形式表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P值<0.05認為差異有統計學意義。

結果

1.葉酸缺乏對自噬關鍵蛋白LC3B表達水平和mRNA水平的影響：mESCs分別在FD組和Control組中培養12 h、24 h、36 h、48 h后，通過免疫印跡雜交法以β-actin作為內參，檢測自噬關鍵蛋白LC3B的表達量。在LC3B的免疫印跡中(圖1)，LC3B通常出現兩條帶，即LC3B-I的表觀分子量為18 KDa，LC3B-II的表觀分子量為16 KDa，但是LC3B抗體與LC3B-II的親和力高于LC3B-I。圖1的結果進行灰度掃描后，將Control組的灰度值均設為1，觀察4個時間點下FD組的LC3B表達量變化(圖1)，僅12 h、36 h的變化具有統計學意義，而且36 h的LC3B表達量上調。該實驗提示當葉酸缺乏條件培養mESCs 36 h，自噬活性可能增強。

通過相對定量PCR法，檢測自噬關鍵基因LC3B在mRNA水平的相對表達量。結果顯示(圖2)，與Control組相比，FD組在4個時間點中僅36 h的差異為1.63倍具有統計學意義(P<0.05)，且表達上調，提示葉酸缺乏條件下培養mESCs 36 h，自噬活性可能增強。

LC3B在mRNA和蛋白水平的趨勢，以36 h最為顯著，48 h出現下降，而12 h時FD組表達量反而低于Control組。

圖1 葉酸缺乏對自噬關鍵蛋白LC3B表達水平的影響

圖2 葉酸缺乏對自噬關鍵蛋白LC3B的mRNA水平影響

2.葉酸缺乏對自噬信號通路上相關基因的影響：FD組和Control組培養36 h的mESCs提取總RNA經反轉錄后，采用SYB Green法實時相對定量PCR檢測葉酸缺乏條件下，PI3K/Akt信號通路上的4個關鍵分子Pi3r1、Pi3r3、Akt1和Foxo3相對正常對照組的表達量變化(圖3)。相對于Control組，FD組中這4個基因中僅Foxo3表達上調1.3倍，差異有統計學意義；而Pi3r1表達下調1.1倍，Pi3r3和Akt1的表達分別上調1.04和1.03倍均未發現有統計學意義。說明Foxo3可能參與葉酸缺乏誘導自噬過程的主要途徑。

圖3 葉酸缺乏對自噬信號通路上相關基因的影響

討論

本實驗分別在葉酸缺乏(FD組)和正常葉酸(Control組)水平兩種條件下培養mESCs，然后在蛋白水平和mRNA水平均對兩組細胞進行自噬關鍵蛋白LC3B的檢測，結果提示細胞培養36 h，FD組的自噬關鍵蛋白LC3B的表達量出現上調且差異有統計學意義，反映自噬活性可能增強，提示葉酸缺乏可能誘導自噬的發生。通常認為當細胞受到外界環境的刺激或在內部環境或條件發生變化時都可以發生自噬上調。其中常見的外部因素包括氨基酸或游離脂肪酸等在內的營養缺乏，以及激素、缺血、缺氧是細胞自噬的重要誘導因素。另外雌激素、雄激素和纖維生長因子-2(FGF-2)等均可誘導細胞發生自噬。內部因素包括細胞器損傷、異常成分積聚或必需成分存在和病原體存在[6]。本實驗證實以葉酸缺乏為例的營養缺乏同樣可能誘導自噬的發生。

LC3B-II的含量或 LC3B-II/LC3B-I的比例與自噬泡的數量呈正相關，在某種程度上反映了細胞的自噬活性[4]。本研究FD組的自噬關鍵蛋白LC3B在mRNA水平和蛋白水平均顯著上調，提示葉酸缺乏誘導的自噬在轉錄水平調控LC3B的表達，有LC3B在mRNA和蛋白水平的趨勢是隨著細胞培養時間的推移，表達量逐漸上調，以36 h最為顯著，48 h出現下降，考慮可能與該時間點部分細胞活性降低有關。而12 h時FD組表達量反而低于Control組，分析可能與培養時間尚短，細胞尚未適應該組的培養基條件，故影響細胞活性，從而影響了蛋白的表達。研究表明，在人和大鼠的自噬過程中，LC3B通常在翻譯后水平受到調控[7]。本研究與現有的研究結論不同的是調控階段的差異，這可能與物種、細胞系和誘導因素的不同有關。

選擇與自噬相關的PI3K/Akt信號通路上的4個關鍵分子Pi3r1、Pi3r3、Akt1和Foxo3，在mRNA水平檢測它們的表達情況[5,8]。本實驗經熒光定量PCR驗證，Pik3r1、Pik3r3、和Akt1在mRNA水平并無明顯變化，但是Foxo3表達上調1.3倍,差異有統計學意義。Pik3r1、Pik3r3和Akt1沒有變化，后續應通過蛋白水平的檢測如免疫印跡雜交證明PI3K/Akt通路是否參與葉酸缺乏誘導的自噬。Foxo3屬于轉錄因子，Mammucari等[9]研究發現肌肉生長中Akt激活了由mTOR介導的蛋白合成，而Foxo介導的蛋白降解則受到抑制。在許多生物體內，Foxo反向調控mTOR信號通路。Foxo3在骨骼肌的自噬中發揮了必要的作用，饑餓狀態下可激活自噬相關蛋白LC3B和Bnip3的轉錄，這個過程正是受到Foxo3的調控。Foxo3作為轉錄因子參與對LC3B的誘導，它是饑餓誘導的自噬中所必需的；在肌肉萎縮中，同時調控著泛素蛋白酶體和自噬溶酶體。由此可以推斷，葉酸缺乏可能使PI3K/Akt通路的信號轉導減弱，對轉錄因子Foxo3的抑制作用減弱從而使促自噬因子Foxo3的表達增加，DNA轉錄水平提高，大量的自噬相關基因如LC3B和Beclin1的高表達最終誘導了自噬的發生。因此，葉酸缺乏誘導的自噬可能主要是通過PI3K/Akt通路參與信號轉導。

本研究提出了葉酸缺乏可能誘導自噬的發生，探索了葉酸缺乏可能與自噬相關，為深入研究神經管畸形的發病機制提供了新的思路[10-11]，為孕期補充葉酸的必要性提供了理論依據。