“青蛙骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備”實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)*

韓 偉 鄒佩貞 石海英 田志環(huán)

（韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院 廣東韶關(guān) 512005）

根據(jù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)科學(xué)出版社《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程（第2 版）》教材中的“青蛙骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備”［1］實(shí)驗(yàn)提出幾點(diǎn)改進(jìn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料的選擇

選擇飼養(yǎng)的青蛙做實(shí)驗(yàn)材料。飼養(yǎng)的青蛙一年四季都可購(gòu)置。青蛙雖然攜帶的寄生蟲比較多，但是相對(duì)安全，一般不攜帶人畜生共患病的病原菌，且實(shí)驗(yàn)前不需要提前很長(zhǎng)時(shí)間購(gòu)買，現(xiàn)做現(xiàn)買，實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備容易方便。為了實(shí)驗(yàn)?zāi)苁占礁嗟墓撬杓?xì)胞，建議購(gòu)買較大的青蛙，一般體重在150～350 g 左右，足夠的體重，才能獲得足夠的細(xì)胞［2］。每2 名學(xué)生用一只青蛙，每名學(xué)生取青蛙的1 條后腿收集骨髓細(xì)胞。

2 秋水仙素的處理

2.1 處理時(shí)間 教材上表述實(shí)驗(yàn)前3～4 h 向動(dòng)物的腹腔注射秋水仙素，這個(gè)處理時(shí)間不是絕對(duì)的。筆者發(fā)現(xiàn)冬天溫度較低時(shí)（例如約10℃時(shí)），提前3～4 h，用秋水仙素處理青蛙，若時(shí)間較短，實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到大部分骨髓細(xì)胞分裂處于前期階段，中期分裂相較少（圖1A）。考慮青蛙冬季冬眠的原因，活動(dòng)量少，應(yīng)提前較多時(shí)間用秋水仙素處理，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在室溫較低時(shí)（低于10℃），可提前10 h 用秋水仙素注射處理，特別是冬季早上做實(shí)驗(yàn)時(shí)，更應(yīng)該在前一天晚上向青蛙腹腔注射秋水仙素，否則準(zhǔn)備不方便。當(dāng)室溫在25℃左右時(shí)可提前3～4 h 用秋水仙素處理，但也要合理安排上實(shí)驗(yàn)課的時(shí)間。

圖1 青蛙骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本的制備圖（10×40）

2.2 用量 秋水仙素的用量，一般根據(jù)青蛙的體重確定。教材按動(dòng)物每克體重2～4 μg 的劑量進(jìn)行注射。實(shí)際按每克青蛙10 μg 進(jìn)行注射也得到了良好的效果（圖1B 和圖1C），這與文獻(xiàn)［2］和教材［3］提及的秋水仙素處理的用量一致。

3 注射生理鹽水

用刀片切開股骨的兩端，用盛有生理鹽水的

注射器插入股骨的上端，沖出骨髓細(xì)胞至離心管中，直至股骨變白色為止。采用盛有0.65% NaCl的注射器插入股骨的上端沖出骨髓細(xì)胞。

4 低滲處理

教材上低滲處理：棄上清液，加入6 mL 蒸餾水，用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸浮液，置于37℃溫箱中低滲20 min［1］。實(shí)驗(yàn)時(shí)改為棄上清液，加入6 mL 0.4% KCl，用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸浮液，置于37℃水浴鍋中低滲30 min。發(fā)現(xiàn)用0.4% KCl低滲對(duì)于不熟練操作的人來說比蒸餾水效果好。這與方玲等［4］和趙剛等［5］采用的低滲液一致。

5 固定液的配制

固定液現(xiàn)配現(xiàn)用，因?yàn)楸姿崛菀讚]發(fā)。采用預(yù)固定和第1 次固定時(shí)配一次，第2 次固定時(shí)再配一次。這樣固定液中的冰醋酸揮發(fā)相對(duì)較少，固定效果好。

6 染色液的配制

Giemsa 染液現(xiàn)配現(xiàn)用。于染色前30 min 將Giemsa 原液用10 倍體積的1／15 mol／L 磷酸緩沖液（pH=7.4）稀釋，配制。

7 滴片

采用濕的冰凍切片，向載玻片上滴加懸浮的骨髓細(xì)胞要有一定的高度。高度太低時(shí)細(xì)胞松散不開，高度太高則細(xì)胞容易滴到載玻片外面，一般離載玻片至少40 cm 進(jìn)行滴片，滴片后用嘴向一個(gè)方向吹氣，使細(xì)胞和染色體充分分散。

8 加熱干燥

滴片置酒精燈上方來回微微加熱干燥。不能在一個(gè)位置加熱干燥，不能過分干燥。

9 顯微鏡觀察

滴片在顯微鏡下觀察，采用逐行觀察、平掃的方式，這樣才容易找到分散均勻的染色體。先在低倍鏡下觀察，再換高倍鏡進(jìn)行觀察。如果能結(jié)合數(shù)碼顯微鏡互動(dòng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行觀察，學(xué)生可拍攝并保存照片，與實(shí)驗(yàn)教師進(jìn)行互動(dòng)，實(shí)驗(yàn)效果會(huì)更好。拍到的照片可用來核型分析（圖1D）。參考周洲等［6］的方法，利用Photoshop 軟件對(duì)圖1D 進(jìn)行染色體核型分析，得到圖2核型分析圖。

圖2 青蛙骨髓細(xì)胞染色體核型分析圖

總之，任何實(shí)驗(yàn)都不能照搬實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教材，指導(dǎo)教材上的方法只是針對(duì)大多數(shù)情況下使用的，做實(shí)驗(yàn)時(shí)要根據(jù)實(shí)際條件和環(huán)境，實(shí)時(shí)調(diào)整，制定合適的實(shí)驗(yàn)步驟，才能得出好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。