高通量二代測(cè)序技術(shù)在耐藥結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

辜吉秀 李晴 馬玲 李銀花 王冬冬 司紅艷

耐藥結(jié)核病的診斷長期依賴于表型藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)，該試驗(yàn)方法用時(shí)比較長，從痰標(biāo)本收集、培養(yǎng)至比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告需要2.5個(gè)月[1]，不能滿足耐藥結(jié)核病及時(shí)精準(zhǔn)診斷及治療。近幾年耐藥結(jié)核病分子診斷已被廣泛應(yīng)用，下一代測(cè)序(next-generation sequencing，NGS)技術(shù)，即“二代測(cè)序技術(shù)”，該方法屬于分子藥敏試驗(yàn)，它采用高通量測(cè)序技術(shù)，在降低測(cè)序成本的同時(shí)，還提高了測(cè)序速度，并且保持了高準(zhǔn)確性。隨著NGS技術(shù)的廣泛使用，探索NGS技術(shù)在結(jié)核病耐藥性診斷中的應(yīng)用有比較大的價(jià)值[2-3]。本研究搜集2016—2017年甘肅省結(jié)核病耐藥基線調(diào)查的150株菌株，采用比例法及NGS技術(shù)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，以比例法藥敏試驗(yàn)結(jié)果為參考標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)NGS技術(shù)對(duì)耐藥結(jié)核病的檢測(cè)效能。

材料和方法

一、材料收集

本研究搜集2016—2017年甘肅省結(jié)核病耐藥基線調(diào)查獲得的150株臨床分離株，其中非結(jié)核分枝桿菌(NTM)2株，剔除NGS檢測(cè)失敗13株，最后納入分析的結(jié)核分枝桿菌菌株為135株。

二、研究方法

1.藥敏試驗(yàn)：使用比例法，培養(yǎng)基中藥物的最終濃度異煙肼：0.2 μg/ml；利福平)：40 μg/ml； 乙胺丁醇：2 μg/ml；鏈霉素：4 μg/ml；氧氟沙星：2 μg/ml；藥敏試驗(yàn)同時(shí)接種對(duì)硝基苯甲酸(PNB)、噻酚二羧酸肼(TCH)鑒別培養(yǎng)基，進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌的初步鑒定。分枝桿菌培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)及菌種鑒定培養(yǎng)管由珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

2．DNA提取：150株菌株用改良的十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)法進(jìn)行DNA提取。使用10 μl一次性接種環(huán)挑取培養(yǎng)菌株2-環(huán),加入0.5 ml三羥甲基氨基甲烷+乙二胺四乙酸(簡稱TE)緩沖液與1.5 ml EB(eppendorf)管中，密封95 ℃ 30 min滅活；離心半徑8 cm ，12 000 r/min 離心5 min，棄上清后菌體沉淀以400 μl TE緩沖液重懸，加入50 μl溶菌酶混勻，37 ℃ 孵育20 h；加入70 μl 10%十二烷基硫酸鈉(簡稱SDS)、5 μl蛋白酶K溶液，混勻，65 ℃孵育10 min；加入10 μl 5 mol NaCL和100 μl CTAB/NaCl溶液，漩渦振蕩混勻、孵育；加入750 μl氯仿/異戊醇(24∶1)，顛倒混勻，離心半徑8 cm，12 000 r/min 離心5 min；吸取上清液至另一支新的離心管，加入450 μl異丙醇沉淀DNA，20 ℃ 孵育30 min；離心半徑8 cm，12 000 r/min 離心15 min,棄上清，加入1 ml 70%乙醇，顛倒清洗DNA；離心棄上清，留20 μl；離心半徑8 cm ，12 000 r/min 離心30 s后吸出剩余液體；室溫干燥，用50 μl TE溶解沉淀，-20 ℃冷凍備用。

3．NGS技術(shù)檢測(cè)：將150份DNA樣本送至中國科學(xué)院微生物所，使用Illumina hiseq Xten測(cè)序儀進(jìn)行PE150雙端測(cè)序，按照500 ng起始量，以H37Rv(ATCC 27294)標(biāo)準(zhǔn)株作為耐藥敏感株進(jìn)行對(duì)照進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序的5種藥物耐藥相關(guān)基因見表1。

表1 五種藥物采用NGS技術(shù)測(cè)序的相關(guān)耐藥基因

4.結(jié)果分析：使用Excel工作表收集藥敏試驗(yàn)結(jié)果；以H37Rv(ATCC 27294)標(biāo)準(zhǔn)株作為陰性對(duì)照菌，對(duì)常見的耐藥相關(guān)位點(diǎn)inhA、katG、embB、ropB、rpsL、rrs、gyrA、gyrB進(jìn)行測(cè)序，使用抗生素綜合檢索數(shù)據(jù)庫(CARD)進(jìn)行耐藥比對(duì)分析。將菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果和測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析。并將二代測(cè)序原始閱讀數(shù)據(jù)(raw reader)結(jié)果上傳美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnotogy Infornation，NCBI)(SRP269873)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以藥敏試驗(yàn)作為參考標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算NGS技術(shù)對(duì)耐藥結(jié)核病檢測(cè)的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。使用SPPS 26.0軟件進(jìn)行兩種方法的一致性Kappa檢驗(yàn)(K<0.40 認(rèn)為一致性較差；0.40≤K<0.75 認(rèn)為一致性一般；K≥0.75認(rèn)為一致性較好[4])。

結(jié) 果

一、NGS對(duì)5種藥物耐藥性檢測(cè)的效能

以藥敏試驗(yàn)結(jié)果作為參考標(biāo)準(zhǔn)，NGS檢測(cè)135株菌株對(duì)異煙肼耐藥的敏感度為88.75%(71/80)，特異度為100.00%(55/55)；NGS技術(shù)對(duì)各藥品耐藥性檢測(cè)的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值見表2。

二、結(jié)核分枝桿菌對(duì)5種藥物耐藥的相關(guān)基因突變類型及頻率分析(表3)

1.異煙肼：對(duì)異煙肼耐藥相關(guān)基因katG、inhA和ahpC間隔區(qū)進(jìn)行檢測(cè)，71株發(fā)生突變，有8種突變類型，其中69株與katG315的突變有關(guān)，突變頻率為97.18%(69/71)，katG315單獨(dú)突變的是64株，聯(lián)合katG315突變菌株5株。比例法藥敏試驗(yàn)71株耐藥菌株中有9株沒有檢測(cè)到突變，55株敏感菌株沒有檢測(cè)到突變。

2.乙胺丁醇：對(duì)乙胺丁醇耐藥相關(guān)基因embB進(jìn)行檢測(cè)， 33株發(fā)生突變，有5種突變類型，其中27株與embB306位點(diǎn)的突變有關(guān)，突變頻率為81.82%(27/33)，單獨(dú)突變25株，聯(lián)合embB306位點(diǎn)突變菌株2株。比例法藥敏試驗(yàn)21株耐藥菌株中有3株沒有檢測(cè)到突變，114株敏感菌株中有15株檢測(cè)到突變。

3.利福平：對(duì)利福平耐藥相關(guān)基因rpoB基因進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增了543 bp相關(guān)片段，包含81 bp利福平耐藥決定區(qū)，即密碼子507～533區(qū)。共有63株發(fā)生突變，共檢測(cè)突變類型18種，突變頻率531位點(diǎn)58.73%(37/63)，526位點(diǎn)14.29%(9/63)，516位點(diǎn)4.76%(3/63)。有59株突變發(fā)生在利福平耐藥決定區(qū)(即密碼子507～533區(qū))，利福平耐藥決定區(qū)突變頻率為93.65%(59/63)，比例法藥敏試驗(yàn)72株耐藥菌株中有11株沒有檢測(cè)到突變，63株敏感菌株中2株檢測(cè)到突變。

表2 NGS檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌是否耐藥的效能

表3 136株結(jié)核分枝桿菌對(duì)5種藥物耐藥的相關(guān)基因突變類型及頻率分析

續(xù)表3

4.鏈霉素：對(duì)鏈霉素耐藥相關(guān)基因rpsL進(jìn)行檢測(cè)，53株發(fā)生突變，有2種突變類型，rpsL43突變42株,突變頻率為79.25%(42/53)；rpsL88突變11株，突變頻率為20.75%(11/53)。比例法藥敏試驗(yàn)69株耐藥菌株中有18株沒有檢測(cè)到突變，66株敏感菌株中有2株檢測(cè)到突變。

5.氧氟沙星:對(duì)氧氟沙星耐藥相關(guān)基因gyrA、gyrB進(jìn)行檢測(cè)，21株發(fā)生突變，有4種突變類型，gyrA94突變16株，突變頻率為76.19%(16/21)；gyrA90突變了2株，突變頻率為9.52%(2/21)；gyrA91突變2株，突變頻率為9.52%(2/21)。比例法藥敏試驗(yàn)29株耐藥菌株中有9株沒有檢測(cè)到突變，106株敏感菌株中有1株檢測(cè)到突變。

討 論

目前認(rèn)為，引起結(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制主要包括細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與組成的變化，使其通透性改變、耐藥質(zhì)粒或者轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的耐藥、酶失活，靶基因的突變等因素，其中最主要引起結(jié)核分枝桿菌耐藥的原因是基因突變[5]。本研究NGS技術(shù)檢測(cè)與比例法藥敏試驗(yàn)相比，檢測(cè)異煙肼、乙胺丁醇耐藥的敏感度均達(dá)到85%以上，檢測(cè)異煙肼、利福平、鏈霉素、氧氟沙星耐藥的特異度均達(dá)到96%以上，檢測(cè)異煙肼、利福平、氧氟沙星一致性較好。

異煙肼耐藥機(jī)制相對(duì)來說較為復(fù)雜，本研究通過對(duì)異煙肼耐藥相關(guān)基因inhA、katG、ahpC間隔區(qū)進(jìn)行檢測(cè)分析，80株耐藥結(jié)核分枝桿菌菌株中，異煙肼耐藥相關(guān)基因katG基因突變率為88.75%(71/80)，主要位于315位點(diǎn)，占katG基因突變的97.18%(69/71)，315位點(diǎn)密碼子由AGC突變成ACC,絲氨酸變?yōu)樘K氨酸，這與美國學(xué)者的報(bào)道基本一致[6-7]。ahpC間隔區(qū)突變率為1.23%(1/81)，該位點(diǎn)突變與INH耐藥后的代償有關(guān)，與INH無直接聯(lián)系，它聯(lián)合katG142位點(diǎn)突變，與上海的一項(xiàng)研究[8]的結(jié)果有差異，主要與異煙肼耐藥相關(guān)基因突變特征因地域的不同而有明顯的差異。

embB基因突變是對(duì)乙胺丁醇耐藥的主要分子機(jī)制[9-10]。21株對(duì)乙胺丁醇耐藥的菌株中18株發(fā)生突變，embB基因突變率為85.71%(18/21)。16株embB基因突變主要發(fā)生在306位點(diǎn)，突變率為88.89%(16/18)。對(duì)乙胺丁醇敏感的114株中測(cè)出11株embB306、4株embB406位點(diǎn)突變，共15株突變菌株，突變率為13.16%(15/114)，乙胺丁醇embB基因耐藥檢測(cè)特異度較低。

利福平耐藥主要由rpoB基因突變引起，本研究72株對(duì)利福平耐藥的菌株中，61株發(fā)生突變，rpoB基因突變率達(dá)84.72%(61/72)。61株rpoB基因突變的耐藥菌株中，突變主要發(fā)生在rpoB531位點(diǎn)，突變率為57.38%(35/61)，rpoB526突變率為14.75%(9/61);rpoB511位點(diǎn)突變率為9.84%(6/61)；rpoB516位點(diǎn)檢出率為4.92%(3/61)，rpoB531、526、511、516位點(diǎn)占全部rpoB基因突變的83.61%(51/61)，檢出rpoB522位點(diǎn)突變菌株2株，與陳燕等[11]的研究一致。57株菌株突變位點(diǎn)位于利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)，1株發(fā)生ropB126CCG-TCG突變，3株發(fā)生ropB251GTC-TTC突變，這4株不在利福平耐藥決定區(qū)。可見，檢測(cè)rpoB基因發(fā)生突變來檢測(cè)利福平結(jié)核分枝桿菌耐藥性具有較高的可靠性，rpoB基因突變的突變率為83.56%(61/73)，低于陳燕等[11]、Yuan等[12]的報(bào)道，原因可能為地域的不同，位點(diǎn)所占比例有差異，12株耐藥菌株未檢測(cè)出rpoB突變，不排除其他基因突變引起或存在其他耐藥機(jī)制。

鏈霉素的耐藥主要是rpsL和rrs的基因突變引起的[13-14]，本研究中69株對(duì)鏈霉素耐藥的菌株中51株發(fā)生突變，rpsL基因突變率為73.91%(51/69)，沒有檢測(cè)到rrs突變類型。51株rpsL基因突變主要發(fā)生在43和88位點(diǎn)上，44位點(diǎn)的突變率為78.43%(40/51)，88位點(diǎn)的突變率為21.57% (11/51)。這與Tracevska 等[15]流行病學(xué)調(diào)查的耐鏈霉素結(jié)核分枝桿菌臨床分離株rps和rrs基因突變的結(jié)果一致。

氧氟沙星的耐藥突變主要在gyrA基因和gyrB基因型上。本研究中29株對(duì)氧氟沙星耐藥的菌株中，gyrA的突變率為68.97%(20/29)；與陳燕等[11]的研究結(jié)果一致。gyrA的突變主要發(fā)生在94和90位點(diǎn)上，gyrA94位點(diǎn)突變者有16株，占總突變的84.21%(16/19)；gyrB的突變率為3.45%(1/29)。

NGS可準(zhǔn)確識(shí)別包括單核苷酸多態(tài)性(SNP)、小片段插入和缺失等各種遺傳多態(tài)性信息，50多個(gè)與結(jié)核耐藥相關(guān)的高頻及低頻突變都能檢測(cè)到，一次性可檢測(cè)多個(gè)樣本，具有通量高的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，對(duì)利福平、異煙肼、氧氟沙星耐藥的檢測(cè)效能較好，能夠滿足臨床耐藥結(jié)核病診斷的需要。NGS對(duì)乙胺丁醇、鏈霉素已知耐藥位點(diǎn)的檢測(cè)效能一般，需要對(duì)其耐藥機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。