頭針療法聯(lián)合重復經(jīng)顱磁刺激對腦卒中大鼠神經(jīng)功能的改善作用及對PKA/CREB信號通路的影響

戈 蕾鄒玉安王曉娜

(1.河北北方學院附屬第一醫(yī)院康復醫(yī)學科,河北張家口 075000;2.河北北方學院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北張家口 075000)

腦卒中是臨床常見腦血管疾病,致殘率、致死率高,已成為影響人類生存的重大疾病之一[1]。腦組織對氧敏感性高,供血供氧不足可引起大量神經(jīng)元死亡,即使及時恢復血供仍不可避免,因此,如何積極有效改善腦卒中后神經(jīng)功能的恢復成為研究重點和難點[2]。頭針療法是根據(jù)中醫(yī)臟腑經(jīng)絡理論,頭部取穴后進行針刺治療各種疾病的療法[3]。重復經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation,rTMS)是用不同頻率磁信號無衰減刺激大腦神經(jīng)、外周肌肉等部位從而達到治療目的的一種方法[4]。近年來,臨床研究證實,頭針療法及rTMS 對腦卒中后運動、認知等神經(jīng)功能障礙均改善作用,兩者配合應用效果確切,但其具體調(diào)控機制仍不明確[5]。本研究通過構建局灶性腦卒中大鼠模型,評估頭針療法聯(lián)合rTMS 對神經(jīng)功能損傷的改善情況,并進一步探討其具體調(diào)控機制,為臨床治療局灶性腦卒中提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性 Wistar 大鼠,50 只,8 周齡,體重180～220 g,由河北省實驗動物中心提供[SCXK(冀)2018-004],動物飼養(yǎng)在河北省實驗動物中心[SYXK(冀)2018-008],實驗經(jīng)河北省實驗動物中心動物審批(IACUC20170324),并按實驗動物使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

BCA 蛋白定量分析試劑盒(批號:23227,美國Thermo 公司);兔抗大鼠蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)單抗、環(huán)磷腺苷反應元件結(jié)合蛋白(cyclic adenosine response element binding protein,CREB)單抗、磷酸化 CREB(phosphorylation-CREB,p-CREB)單抗(一抗,批號:ab38949、ab32515、ab32096)、辣根過氧化物酶標記的 PKA、CREB、p-CREB IgG 抗體(二抗,批號:ab5815、ab32096、ab25417),(美國Abcam 公司);LH202H 韓氏治療儀(北京華威有限公司);磁刺激器及圓形線圈(丹麥Dantec 公司);Morris 水迷宮及圖像自動采集和處理系統(tǒng)(基爾頓生物科技(上海)有限公司);電泳儀、CheniDoc XRS化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備

參考文獻[6]應用線栓法制備局灶性腦卒中模型大鼠:腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉麻醉,頸部消毒備皮,暴露頸總動脈,微小動脈夾夾閉頸總動脈,頸外動脈殘端剪一直徑0.2 mm 小口,并逆向插入尼龍線約18 mm(尼龍線頭部加熱使之為球形),結(jié)扎頸外動脈殘端小口,縫合皮膚,尼龍線總長度約4 cm。缺血2 h 后,輕握大鼠外拉尼龍線,至有阻力感時提示尼龍線已至頸外動脈殘口,恢復大腦中動脈血供,剪斷體表尼龍線;術后自由飲水、單籠飼養(yǎng)。模型組、頭針組、rTMS 組、聯(lián)合組大鼠按照上述方法制備模型。術后24 h 評估建模情況,0 分:提尾實驗前爪伸直,無神經(jīng)功能缺陷;1 分:提尾實驗左前肢屈曲;2 分:行走時向左轉(zhuǎn)圈;3 分:向偏癱側(cè)傾倒;4分:不能行走、意識昏迷。1 ～3 分大鼠模型制備成功,參與后續(xù)實驗。假手術組除不插入尼龍線栓外,其余操作同前。

1.3.2 分組及干預方法

50 只大鼠隨機分為假手術組、模型組、頭針組、rTMS 組、聯(lián)合組,各 10 只。模型組 9 只、頭針組 8 只、rTMS 組 8 只、聯(lián)合組 9 只建模成功,術后24 h 開始干預。頭針組給予頭針療法:大鼠穴位依據(jù)華興邦等[7]編寫的大鼠穴位圖譜進行定位,依據(jù)《頭針穴名國際標準化方案》選穴:頂顳后斜線、頂顳前斜線;采用30 號一次性無菌針灸針,進針深度約5 mm,進針后接通韓氏治療儀(疏密波、頻率2/100 Hz、電流強度2 mA),每次20 min,每天 1 次,共10 d。rTMS 組給予 rTMS:圓形線圈緊貼頭皮固定于大腦右半球,線圈中心位于右耳前約1 cm,設置磁刺激器刺激頻率0.5 Hz,脈沖刺激強度峰值2T,輸出強度70%,連續(xù)20 次重復刺激為1 組,每天2 組,共10 d。聯(lián)合組給予頭針療法聯(lián)合rTMS,方法及療程同上,首先給予rTMS,然后進行頭針療法,間隔2 h。模型組和假手術組不做處理。

1.3.3 神經(jīng)功能缺損評分及行為學測試

末次干預后進行大鼠神經(jīng)功能缺損評分,評分方法同前:0 分:提尾實驗前爪伸直,無神經(jīng)功能缺陷;1 分:提尾實驗左前肢屈曲;2 分:行走時向左轉(zhuǎn)圈;3 分:向偏癱側(cè)傾倒;4 分:不能行走、意識昏迷。神經(jīng)功能缺損評估結(jié)束后進行Morris水迷宮實驗,按照文獻[8]方法進行操作,實驗包括兩部分,定位巡航實驗(頭針、rTMS 干預結(jié)束后次日開始,連續(xù)5 d)及空間探索實驗(定位巡航實驗結(jié)束后次日,共1 d),記錄定位巡航第5天各組大鼠平均逃避潛伏期,記錄空間探索實驗大鼠在目標象限停留時間,兩指標反應大鼠學習及記憶能力。

1.3.4 腦組織標本采集及染色

處死各組大鼠,置于生理鹽水冰盤,于顳葉以梗死灶為中心冠狀切腦組織(包括梗死灶周圍皮質(zhì)),切 4 刀共 5 片腦組織,間隔 2 mm 左右。其中每只各取1 片置于2% TTC 中避光染色,孵育30 min(37℃),取出腦片放入10%福爾馬林中避光保存過夜,拍照觀察梗死灶情況。每只另取1 片置于10%中性甲醛中固定,進行常規(guī)石蠟包埋,以梗死灶為中心進行冠狀位切片,取切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水、步驟,進行常規(guī)蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色,中性樹膠封片后于光學顯微鏡下觀察梗死灶周圍皮質(zhì)組織病理學改變。

1.3.5 PKA、CREB、p-CREB 蛋白相對表達量檢測

取部分梗死灶腦組織(包括梗死灶周圍皮質(zhì)、海馬及側(cè)腦室),液氮中研磨轉(zhuǎn)至離心管,加入0.5 mL 細胞裂解液,于冰上孵育裂解20 min,12000 r/min 離心15 min,離心半徑12 cm,取離心上清液,進行BCA 蛋白定量,取待測樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳分離,將分離膠置于電轉(zhuǎn)儀上恒定電壓轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜后加入封閉液室溫孵育2 h,加入稀釋一抗(1 ∶500),4℃搖床過夜,PBST 洗滌后加入稀釋二抗(1 ∶5000),室溫繼續(xù)孵育2 h,PBST 再次洗滌3 次后,于暗室中曝光和顯影,凝膠成像系統(tǒng)掃描后,運用圖像分析軟件分析各條帶灰度值,相對表達量以 PKA、CREB、p-CREB 與 β-actin 灰度值表示。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù),計量資料均以平均數(shù)±標準差(±s)表示,計量資料經(jīng)正態(tài)分布和方差齊性檢驗后,多樣本比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),兩兩之間比較采用LSD檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

假手術組一般狀況正常,模型組造模期間均出現(xiàn)左前肢癱瘓、蜷臥懶動、精神萎靡、消瘦等情況,頭針組和rTMS 組干預后精神狀態(tài)稍有好轉(zhuǎn),但左前肢仍癱瘓;聯(lián)合組干預后精神狀態(tài)較頭針組和rTMS 組好轉(zhuǎn),左前肢癱瘓明顯減輕。

2.2 神經(jīng)功能缺損程度評分比較

神經(jīng)功能缺損程度評分組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=137.246,P＜0.001);與假手術組比較,模型組、頭針組、rTMS 組、聯(lián)合組神經(jīng)功能缺損程度評分均升高(P＜0.05);與模型組比較,頭針組、rTMS 組、聯(lián)合組神經(jīng)功能缺損程度評分均降低(P＜0.05),且聯(lián)合組低于頭針組、rTMS 組(P＜0.05);頭針組與rTMS 組神經(jīng)功能缺損程度評分比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表1。

2.3 逃避潛伏期及目標象限停留時間比較

逃避潛伏期、目標象限停留時間組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與假手術組比較,模型組、頭針組、rTMS 組及聯(lián)合組逃避潛伏期均延長,目標象限停留時間均縮短(P＜0.05);與模型組比較,頭針組、rTMS 組及聯(lián)合組逃避潛伏期均縮短,目標象限停留時間均延長(P＜0.05);與頭針組和rTMS組比較,聯(lián)合組逃避潛伏期縮短,目標象限停留時間延長(P＜0.05);頭針組與rTMS 組逃避潛伏期、目標象限停留時間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表2。

2.4 各組腦梗死灶TTC 染色觀察

假手術組腦組織TTC 染色均勻;模型組缺血側(cè)大腦皮層可見白色梗死灶,并伴有輕度糜爛;頭針組、rTMS 組和聯(lián)合組缺血側(cè)大腦皮層梗死面積縮小,腦組織外觀有所改善,聯(lián)合組改善效果最為明顯,見圖1。

2.5 梗死灶周圍皮質(zhì)病理組織學觀察

HE 染色結(jié)果顯示,假手術組大腦皮質(zhì)結(jié)構正常,神經(jīng)元細胞形態(tài)正常;模型組腦組織結(jié)構疏松,呈現(xiàn)篩網(wǎng)狀液化性壞死狀態(tài),神經(jīng)元大量消失,多量小膠質(zhì)細胞浸潤(圖2B);頭針組和rTMS 組腦組織結(jié)構破壞輕于模型組,仍可見部分正常神經(jīng)元形態(tài),但部分神經(jīng)元細胞核周圍細胞質(zhì)呈現(xiàn)空泡化、水腫狀態(tài);聯(lián)合組腦組織結(jié)構及神經(jīng)元形態(tài)趨于正常,見圖2。

表1 神經(jīng)功能缺損程度評分比較( ±s,分)Table 1 Comparison of neurological deficit scores ( ±s,score)

表1 神經(jīng)功能缺損程度評分比較( ±s,分)Table 1 Comparison of neurological deficit scores ( ±s,score)

注:與假手術組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與頭針組比較,cP＜0.05;與rTMS 組比較,dP＜0.05。Note.Compared with sham operation group,aP＜0.05.Compared with model group,bP＜0.05.Compared with scalp group,cP＜0.05.Compared with rTMS group,dP＜0.05.

組別Groups n 神經(jīng)功能缺損程度評分Neurological deficit score假手術組Sham operation group 10 0.00±0.00模型組Model group 9 2.52±0.31a頭針組Scalp group 8 2.01±0.20ab rTMS 組 rTMS group 8 2.03±0.21ab聯(lián)合組Combined group 9 1.69±0.20abcd

表2 逃避潛伏期及目標象限停留時間比較( ±s,s)Table 2 Comparison of escape latency and target quadrant stay time

表2 逃避潛伏期及目標象限停留時間比較( ±s,s)Table 2 Comparison of escape latency and target quadrant stay time

注:與假手術組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與頭針組比較,cP＜0.05;與rTMS 組比較,dP＜0.05。Note.Compared with sham operation group,aP＜0.05.Compared with model group,bP＜0.05.Compared with scalp group,cP＜0.05.Compared with rTMS group,dP＜0.05.

組別Groups n 逃避潛伏期Escape latency目標象限停留時間Target quadrant stay time假手術組 Sham operation group 10 26.59±3.17 45.11±3.69模型組Model group 9 49.88±4.12a 20.56±2.85a頭針組 Scalp group 8 44.30±3.90ab 28.73±2.94ab rTMS 組 rTMS group 8 43.69±3.85ab 29.05±3.07ab聯(lián)合組 Combined group 9 38.21±3.31abcd 33.24±3.12abcd

圖1 各組腦梗死灶TTC 染色觀察Figure 1 General observation of cerebral infarction in each group

圖2 梗死灶周圍皮質(zhì)HE 染色(n=4)Figure 2 HE staining around the infarcted cortex

2.6 腦組織 PKA、CREB、p-CREB 蛋白相對表達量比較

腦組織PKA、p-CREB 蛋白相對表達量組間比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);腦組織CREB 蛋白相對表達量組間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與假手術組比較,模型組、頭針組、rTMS 組及聯(lián)合組PKA、p-CREB 蛋白相對表達量均降低(P＜0.05);與模型組比較,頭針組、rTMS 組及聯(lián)合組PKA、p-CREB 蛋白相對表達量均升高(P＜0.05);聯(lián)合組PKA、p-CREB 蛋白相對表達量高于頭針組和rTMS 組(P＜0.05),而頭針組與 rTMS 組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見圖3A、3B。

3 討論

近年來我國腦卒中發(fā)病率呈升高趨勢,其發(fā)病原因多種多樣,如高血壓、糖尿病、心臟病等多種因素均可引起動脈粥樣硬化,進而導致腦組織缺血缺氧,神經(jīng)元結(jié)構和功能喪失,致殘、致死風險高[9-11]。腦組織血供恢復后的繼發(fā)性損傷,大量自由基、炎癥因子等可繼發(fā)性引起神經(jīng)元死亡,影響神經(jīng)功能的恢復[12]。因此,及時減輕腦卒中后繼發(fā)性神經(jīng)功能損傷,同樣對疾病的治療及預后有重要意義。

圖3 腦組織PKA、CREB、p-CREB 蛋白表達情況(n=4)Figure 3 Expression of PKA,CREB and p-CREB proteins in brain tissue

頭針療法屬中醫(yī)傳統(tǒng)治療腦卒中方法,現(xiàn)代研究證實,頭針療法可通過促進腦組織海馬神經(jīng)元增殖,改善腦卒中后認知功能障礙[13]。研究顯示,頭針療法可通過改善氣虛血瘀證腦卒中患者血液流變學指標,進而改善患者認知功能[14]。本研究中頭針組大鼠神經(jīng)功能損傷評分較模型組均升高,逃避潛伏期均縮短,目標象限停留時間均延長,證實頭針療法對腦卒中認知神經(jīng)功能的改善作用。既往研究發(fā)現(xiàn),rTMS 可有效增加腦卒中大鼠血流量,進一步將該療法用于臨床,取得一定成效[15]。靳靜娜等[16]研究顯示,rTMS 聯(lián)合運動訓練可有效激活腦組織靜息態(tài)腦網(wǎng)絡,促進運動功能恢復。以上研究說明rTMS 對腦卒中后腦組織活性恢復具有顯著恢復作用。本研究中rTMS 組大鼠神經(jīng)功能損傷評分較模型組均升高,逃避潛伏期均縮短,目標象限停留時間均延長,提示rTMS 具有改善腦卒中大鼠神經(jīng)功能的作用。此外,本研究將頭針療法和rTMS療法聯(lián)合應用后,神經(jīng)功能損傷評分升高、逃避潛伏期均縮短、目標象限停留時間均延長現(xiàn)象更為顯著,HE 染色顯示聯(lián)合組腦組織結(jié)構破壞最輕,證實頭針療法聯(lián)合rTMS 對腦卒中大鼠神經(jīng)功能的改善具有協(xié)同加強作用。

本研究發(fā)現(xiàn),頭針組、rTMS 組及聯(lián)合組PKA、p-CREB 蛋白表達均高于模型組,且聯(lián)合組高于頭針組和rTMS 組,說明頭針療法聯(lián)合rTMS 可能通過激活PKA/CREB 信號通路發(fā)揮改善腦卒中大鼠神經(jīng)功能作用。PKA 在哺乳動物神經(jīng)元內(nèi)表達豐富,既往研究已證實,PKA 是突觸可塑性必須因子,對長時記憶有重要作用[17]。CREB 是位于細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)導因子,可被PKA 磷酸化激活,從而啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄,刺激腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷濃度,參與介導神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控[18-19]。Teng等[20]研究表明,CREB 磷酸化表達增強有助于改善缺血性腦損傷大鼠認知、記憶能力。屈夏夏等[21]證實,PKA/CREB 信號通路在改善阿爾茲海默病小鼠空間學習、記憶能力方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。上述研究均證實PKA/CREB 信號通路在腦神經(jīng)元損傷修復過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用,本研究應用頭針組及rTMS 聯(lián)合干預后PKA/CREB 信號通路被激活,且大鼠神經(jīng)功能相應改善,提示聯(lián)合干預可能通過激活該信號通路發(fā)揮調(diào)控作用。

綜上所述,頭針療法聯(lián)合rTMS 可有效改善腦卒中大鼠神經(jīng)功能,其作用機制可能通過激活PKA/CREB 信號通路發(fā)揮調(diào)控作用,為頭針療法聯(lián)合rTMS 應用于缺血性腦卒中臨床治療提供理論依據(jù)。