雞舍空氣中葡萄球菌的分離鑒定及耐藥性分析

盧苑青　張騰飛　邵華斌　曾馳

摘要：凝固酶陰性葡萄球菌是廣泛存在于自然界中的一種革蘭氏陽性條件致病菌，畜禽養殖舍是其病原體傳播的一個重要傳染源，但其在家禽舍氣溶膠中的流行情況和特征并不明確。通過對從家禽養殖舍生物氣溶股采集而來的細菌進一步分離鑒定，共獲得了 102株凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase-negativestaphyolcocci，CoNS），其中松鼠葡萄球菌（41.18%）是最主要的菌種，此外還包括馬胃葡萄球菌（21.57%）、腐生葡萄球菌（18.63%）、溶血葡萄球菌（10.78%）、木糖葡萄球菌（5.88%）等。耐藥性分析結果顯示，分離的葡萄球菌對青霉素、氨芐西林、環丙沙星、氯霉素、紅霉素、四環素、克林霉素和苯唑西林均呈現高耐藥率。PCR檢測結果顯示，有36.3%的菌株攜帶有耐藥基因mecA，且均對苯唑西林耐藥，而mecA是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的標志耐藥基因。

關鍵詞：家禽舍;氣溶股;凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase-negative staphylccocci，CoNS）;耐藥性;mecA

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020） 16-0118-04

D0I：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.026

凝固酶陰性葡萄球菌（coagulase-negative Staph-ylococci，CoNS）是一類條件致病菌，廣泛存在于粉塵、土壤、水源和空氣中[1]。CoNS可以導致人類和禽類患病，在人群中，它是重要的感染病原體，常可引發心內膜炎或敗血癥[2，3];在家禽中，CoNS的感染可以引起關節炎、纖維蛋白性瞼緣炎及全身性感染。另外，耐甲氧西林的凝固酶陰性葡萄球菌（methicillin-resistant coagulase-negative Staphylococ-ci，MRCoNS）導致雞肉污染的報道也常有發生，顯示出該細菌食源性傳播的可能性[4，5]。

有關抗生素的濫用、多重耐藥的葡萄球菌報道激增[6]，耐藥性的增加同樣限制了治療時的藥物選擇。同時，葡萄球菌廣泛存在于如醫院、畜牧場等抗生素濫用的地方，從而進一步加劇了細菌對耐藥性基因的獲取[7，8]。耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（methicillin一resistant Staphylococcus aureus，MRSA）及耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌（vancomycin-resis-tant S. aureus，VRSA）被大量報道，這些細菌與CoNS攜帶為相似的基因，如耐甲氧西林的mecA[9]。CoNS因其可在空氣中傳播的性質，有可能成為這些抗性基因擴散的源頭，而這也嚴重威脅到公共衛生安全。

空氣傳播是細菌與病毒在家禽養殖舍中傳播的重要途徑，禽舍空氣主要包括細菌、病毒、霉菌以及其組成物如內毒素，這些都是動物和人類感染的潛在致病源。對瑞士12個養殖舍的分析指出，養殖舍中細菌暴露的平均水平在5.3×108個/m3，而其中6.2×107個/m3都是葡萄球菌表明除了動物糞便及污水，雞舍中空氣對動物和人類的健康安全也可造成潛在威脅，是向環境中傳播病原體和致病基因的重要途徑。在加拿大，腸球菌、大腸桿菌和葡萄球菌是養殖舍中傳播最廣泛的3個菌群，并在生物氣溶膠中發現了很高水平的耐桿菌肽鋅、紅霉素、四環素的基因[11]。對MRCoNS攜帶的耐藥基因鑒定表明，當人接觸了攜菌動物時，很有可能被MRCoNS傳染從而獲得耐藥基因存在于葡萄球菌的盒式移動元件SCCmec中，耐甲氧西林的抗性決定簇（即mec決定簇）在葡萄球菌種之間是可自由傳播的，廣泛分布在金黃色葡萄球菌和CoNS之間[12，13]，是導致耐甲氧西林葡萄球菌大量存在的主要原因。本研究探究雞舍空氣中葡萄球菌的流行情況及耐藥性情況，為禽舍的養殖提供指導，并以此為基礎為下一步驗證耐藥基因在不同種屬葡萄球菌之間的傳播性打下基礎。

1材料與方法

1.1 菌株

研究所用菌株大腸桿菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 25923均來自湖北省農業科學研究院畜牧獸醫研究所實驗室保存。

1.2 試劑與儀器

BioSampler采樣器購于美國SKC公司，2×RTaq MasterMix購于北京索萊寶科技有限公司，Muel-ler-Hinton Agar、Mueller-Hinton Broth、Tryptic SoyAgar、Tryptic Soy Broth 購于美國 BD 公司。

1.3方法

1.3.1細菌的培養與鑒定 2017年4月至7月及2018年期間，從華中地區9家雞舍空氣中采集了樣品，以監控雞舍養殖過程中細菌的變化情況。樣品的采集時間為換籠期前的最初90 d生長期。根據中國室內空氣質量標準（GB/T18883—2002）選取5個均勻分布在雞舍的采樣點采集了生物氣溶膠。將氣溶膠收集到20 mL PBS溶液中，保存于冰浴中50mL無菌離心管中，然后立即轉移到實驗室進行分離。使用Tryptic Soy Agar平板對收集到的細菌進行純化培養，挑選出疑似的葡萄球菌菌落，并使用16 S rRNA序列分析和微生物鑒定系統Phoenix-100進行鑒定。純化后的菌液與60%甘油1：1混合置于-80℃保存備用。

1.3.2 引物設計與合成 根據Bitrus等[14]的方法設計合成了16SrRNA通用引物及mecA，擴增長度分別為1 500J63 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列分別為：16SF：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，16SR：5'GGTTACCTTGTTACGACTT-3';mecAF：5'-ACTGCTATCCACCCTCAAAC-3'，mecAR：5'-CTGGTGAAGTTGTAATCTG-3'。

1.3.3 模板制備及PCR擴增 將疑似葡萄球菌劃線接種于TSA平板上，37℃過夜培養得到純化后的單菌落，挑單菌落溶于200 μLddH2O中，煮沸15min后置于冰上15 min，13 000 r/min離心4 min，取上清液作為PCR模板。

PCR反應擴增反應總體系為25 μL，包括：2×Es Taq MasterMix 12.5μL （包括 Es Taq DNA Poly-merase， 2×Es Taq PCR Buffer， 3 mmol/L MgCl2， 400μmol/L dNTP mix），DNA 模板 2 μL，上、下游引物各1 μL，滅菌去離子水8.5 μL。PCR擴增的條件均為94℃預變性 5 min;94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 1 min，72℃延伸5min，共35個循環;72℃延伸5min。配置1%瓊脂糖凝膠（mecA條帶電泳時需配置2%瓊脂糖凝膠），取5μLPCR產物加樣，140V電壓電泳15min，DNA譜帶用嗅化乙錠染色，并使用GelDocXR系統（美國Bio-Rad公司）拍照、分析結果。

將16S rRNA PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，BLAST驗證細菌是否為葡萄球菌;觀察163 bp處有無特異性條帶出現，若有則可判斷該細菌中存在耐藥基因mecA。

1.3.4 藥物敏感性試驗 將分離得到的葡萄球菌使用紙片擴散法或最小抑菌濃度（minimum inhibitoryconcentration，MIC）測定法測試其對不同抗生素的敏感性。根據臨床和實驗室標準協會（CLSI）的操作要求，將藥敏片放置于涂布了葡萄球菌菌液的Mueller-Hinton瓊脂（MHA）平板表面，37 ℃下培養24 h。藥敏片包括青霉素、氨芐西林、環丙沙星、氯霉素、紅霉素、四環素、阿米卡星、利福平和克林霉素。按照CLSI文件測量并分析抑菌圈直徑。

對不適合使用藥敏片的抗菌藥物進行MIC試驗，以確定葡萄球菌對苯唑西林（根據CLSI文件，用于確認其對甲氧西林的耐藥性）和萬古霉素的耐藥性，評估濃度為苯唑西林為0.125～128 μg/mL，萬古霉素為0.125～6 μg/mL。該試驗使用大腸桿菌ATCC 25922和金黃色葡萄球菌ATCC 25923菌株作為質控菌株。

2 結果與分析

2.1 細菌種屬鑒定分析

對從雞舍空氣中收集的細菌進行分析，細菌總數隨著養殖時間的推移而增加，到后期絕大部分細菌為葡萄球菌。通過16SrRNA分析可知，共有102株凝固酶陰性為葡萄球菌，CoNS是其中的主要屬，其結果如表1所示。松鼠葡萄球菌是最主要菌種，占全部CoNS的41.18%，其次是馬胃葡萄球菌和腐生葡萄球菌，分別為21.57%及18.63%，除此之外還有溶血葡萄球菌（10.78%）、木糖葡萄球菌（5.88%）、阿爾萊特葡萄球菌（0.98%）、雞葡萄球菌（0.98%）等。

2.2耐約基因檢測結果

通過對102株葡萄球菌耐藥基因的擴增鑒定，mecA陽性及陰性結果如表1所示。攜帶有mecA基因的葡萄球菌共有37株，陽性率為36.27%，其中松鼠葡萄球菌中有71.43%攜帶有耐藥基因，另外在馬胃葡萄球菌、木糖葡萄球菌和雞葡萄球菌中也有mecA的陽性菌株，陽性率分別為18.18%、33.33%、100%。

2.3 葡萄球菌藥敏試驗結果

用紙片擴散法檢測102株葡萄球菌對9種抗生素的敏感性結果如圖1所示。菌株對廣泛應用于動物養殖中的抗生素耐藥率較高，分別為青霉素（69.61 %）、氨芐西林（58.82%）、環丙沙星（66.67%）、氯霉素（93.14%）、紅霉素（48.04%）、四環素（91.18%）和克林霉素（45.10%）。相比之下因在養殖中的應用較少，阿米卡星（6.86%）和利福平（20.59%）的耐藥率較低。與mecA陰性菌株相比，mecA陽性菌株對青霉素、氨芐西林和環丙沙星的耐藥率較高，對紅霉素和克林霉素的耐藥率較低。

苯唑西林和萬古霉素這兩種重要抗生素的敏感性則通過MIC檢測（表2），有49.0%菌株苯唑西林的MIC值大于2 μg/mL，40.2%菌株萬古霉素的MIC值在4～8 μg/mL，為中等水平;在mecA陽性菌株中，100%的菌株苯唑西林MIC值大于2 μg/mL，而在mecA陰性菌株中只有20%苯唑西林MIC值大于2 μg/mL，與陽性菌株相比有較大差異，陽性菌株對苯唑西林的耐藥率較高。

3小結與討論

從雞舍空氣氣溶膠中分離出了102株葡萄球菌，對葡萄球菌進一步鑒定得知，它們都屬于凝固酶陰性葡萄球菌。通過對菌株mecA基因的鑒定，36.27%的CoNS攜帶有抗性基因mecA。由于在養殖過程中抗生素的大量使用，細菌對部分抗生素如氯霉素、四環素、環丙沙星等耐藥率較高，而對養殖過程中不常使用的抗生素如阿米卡星和利福平則耐藥率較低，針對甲氧西林和萬古霉素兩種不適用紙片擴散法的藥物，MIC試驗結果顯示，mecA陽性菌株對苯唑西林的MIC值均大于2 μg/mL，明顯高于mecA陰性菌株。

近年來，禽類規模化養殖變得越來越普遍，但環境與公共健康問題也隨之而來，生物氣溶膠是其中重要的一部分。通過跟蹤養殖舍不同周期的空氣中微生物的含量，發現其濃度隨著家禽日齡的增長而增長，其中葡萄球菌這一潛在致病菌顯著增加。氣溶膠中存在著大量不同種類的細菌，如芽孢桿菌、假單胞菌、大腸桿菌、葡萄球菌及鏈球菌等，就本研究中葡萄球菌來說，本是一種條件致病菌，但由于近年來抗生素的大量使用，使一部分葡萄球菌獲得了耐藥性，給禽類養殖及臨床用藥都帶來了一定的影響，隨著氣溶膠擴散傳播，也給在養殖舍工人帶了健康威脅。

通過對收集的102株葡萄球菌進一步探究，了解它們的種屬，在對其進行藥物敏感性試驗時，部分菌株表現出了耐藥現象，甚至有些菌株為多重耐藥菌株，警示對抗生素的使用應更加謹慎。另外，通過PCR技術對有無mecA基因進行的驗證顯示，有36.3%的葡萄球菌都攜帶該基因，對苯唑西林亦有耐藥性（MIC≥2 μg/mL）。相關文獻[15]報道攜帶有耐藥基因的CoNS成為耐藥基因的儲存庫和傳播源，以上結果顯示，養殖舍氣溶膠中的CoNS不僅對養殖業有不利影響，也會威脅公共健康安全，本研究揭示了葡萄球菌在家禽養殖過程中產生的不利影響，由于其傳播性，其危害不僅針對禽類，也對雞舍工人的健康造成威脅。本研究給深入研究家禽養殖過程中CoNS的流行性及耐藥性提供依據和基礎的同時，也揭示研究其所攜帶耐藥基因傳播性的必要性與緊迫性。

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收稿日期：2020-01-14

基金項目：現代農業產業技術體系資助項目（nycytx-41-G13）

作者簡介：盧苑青（1994-），女，山東東營人，在讀碩士研究生，研究方向為禽細菌病的流行病學，（電話）17671647921 （電子信箱）wanylu@out-look.com;通信作者，張騰飛，副研究員，（電子信箱）tfzhang23@ 163.com。