一株耐鹽性α-淀粉酶高產(chǎn)菌的分離、鑒定及誘變選育

張偉　吳曉衛(wèi)　姚彥紅　張芬芬　周曉倫

摘要：從土壤中分離篩選出一株產(chǎn)α-淀粉酶的耐鹽性菌株NWU-8，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rRNA基因序列分析，將NWU-8菌株鑒定為Halorubrum sp.，初始淀粉酶活力為32 U/mL。為提高該菌株產(chǎn)α-淀粉酶的能力，采用He-Ne激光照射手段對(duì)其進(jìn)行誘變育種，所獲突變株NWU-8-14產(chǎn)α-淀粉酶活力達(dá)到138 U/mL，產(chǎn)酶活力提升331%。此外，在鹽濃度高達(dá)35%時(shí)，其α-淀粉酶活力仍然保持80 U/mL。NWU-8-14作為一種高產(chǎn)淀粉酶的噬鹽菌在食品發(fā)酵及環(huán)境保護(hù)方面有廣闊的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：淀粉酶;嗜鹽菌;誘變;酶活力

中圖分類(lèi)號(hào)：TS201 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020） 16-0130-04

DOI： 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.029

耐鹽性α-淀粉酶是在含鹽量較高的條件下能水解淀粉的酶類(lèi)，廣泛用于高鹽環(huán)境下淀粉質(zhì)原料的加工，如醬油的釀造[1]、工業(yè)副產(chǎn)品的加工[2]和垃圾的處理[3]等。特別是在高鹽稀態(tài)醬油釀造過(guò)程中，由于鹽水濃度的影響會(huì)導(dǎo)致普通微生物酶類(lèi)失活而影響其水解和發(fā)酵作用，而在此過(guò)程中添加耐鹽性淀粉酶可有效提高淀粉和還原糖的轉(zhuǎn)化率，從而使原材料中的淀粉得以有效利用。其中，微生物淀粉酶以其易于大規(guī)模發(fā)酵和純化等特點(diǎn)而被人們視為工業(yè)淀粉酶的重要來(lái)源。迄今為止，已有關(guān)于耐酸性淀粉酶產(chǎn)生菌、耐高溫淀粉酶產(chǎn)生菌等的大量報(bào)道[4，5]，但是鮮有關(guān)于耐鹽性淀粉酶產(chǎn)生菌應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的報(bào)道。

為獲得遺傳性狀穩(wěn)定的耐鹽性α-淀粉酶產(chǎn)生菌，本研究從陜西省定邊縣鹽湖土壤分離得到1株耐鹽性產(chǎn)淀粉酶的菌株NWU-8，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化和16SrRNA鑒定，結(jié)果顯示該菌株為Halorubrum sp.。為提高其耐鹽能力和產(chǎn)淀粉酶活力，運(yùn)用He-Ne激光對(duì)其進(jìn)行誘變育種，獲得1株高產(chǎn)淀粉酶的耐鹽性菌株NWU-8-14，以期為耐鹽性淀粉酶產(chǎn)生菌的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)及在食品發(fā)酵和環(huán)境保護(hù)中的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 培養(yǎng)基

1） 培養(yǎng)基a：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 100g，去離子水 1 000 mL，pH 7.5。

2） 培養(yǎng)基b：酸水解酪蛋白5g，酵母浸膏12g，蛋白胨6g，可溶性淀粉10 g，檸檬酸三鈉3 g，KCl 3 g，MgS04·7H20 18 g，F(xiàn)eS04·7H20 0.001 g，NaCl 100 g，去離子水 1000 mL，pH 7.5。

3） 培養(yǎng)基c：玉米粉30 g，玉米漿30 g，CaCl2 13 g，Na2HP043 g，（NH4）2S04 4 g，去離子水 1 000 mL，pH7.5。以上培養(yǎng)基均在1×105 Pa滅菌30 min。

1.1.2 土樣采自陜西省定邊縣鹽湖土壤。

1.2方法

1.2.1 嗜鹽菌株分離 所采集的土壤樣品經(jīng)過(guò)2周自然干燥，取10g 土壤到90 mL無(wú)菌水中，置于搖床上150 r/min振蕩30 min充分混勾，得到10-1 土樣稀釋液，再依次稀釋到1×10-4/1×10-5和1×10-6，及取0.2 mL稀釋液均勻涂布在培養(yǎng)基a平板上，30℃倒置培養(yǎng)72 h[6]。挑取單菌落反復(fù)劃線，確保得到純單菌并置于斜面（培養(yǎng)基a）保存。

1.2.2 產(chǎn)淀粉酶菌株篩選 選取斜面保存菌株接種于b培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)7 d，用盧氏碘液染色。對(duì)應(yīng)菌株接入c液體培養(yǎng)基中進(jìn)行37℃搖瓶發(fā)酵72 h，對(duì)發(fā)酵液離心，轉(zhuǎn)速6 000 r/min，低溫離心時(shí)間10 min，取上清液測(cè)定酶活力。根據(jù)菌落直徑和染色圈大小，計(jì)算染色圈直徑/菌落直徑[6]，初步評(píng)價(jià)各菌株產(chǎn)淀粉酶的能力，確定產(chǎn)淀粉酶效果最佳菌株。每個(gè)操作重復(fù)3次。

1.2.3 菌株形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定 采用顯微鏡觀察菌體形態(tài)，參照《微生物學(xué)試驗(yàn)手冊(cè)》[7]《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[8]進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.4 16S rRNA基因序列分析提取菌株的總基因組DNA，以此為模板，利用細(xì)菌16SrDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和1492R （5'-CTACGGTTACCTTGTTACGAC-3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25μL，熱循環(huán)參數(shù)如下：94 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃變性 1 min，55℃退火 1min，72 ℃延伸 2 min，循環(huán) 30 次，72℃延伸 10 min。瓊脂糖凝膠電泳回收目的條帶，并與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞并進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，測(cè)序由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院完成。序列通過(guò)NCBI比對(duì)分析，采用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[9]。

1.2.5 He-Ne激光誘變育種

1） 菌懸液制備。將培養(yǎng)7 d的斜面用無(wú)菌水沖洗，沖洗液盛放在已滅菌的含有玻璃珠的三角瓶中，在往復(fù)式搖床上150 r/min、37℃充分振蕩培養(yǎng)30min，使菌株充分分散，誘變處理之前將菌懸液稀釋至 1×106個(gè)/mL。

2） He-Ne激光誘變。用滅菌的移液管吸取2mL菌懸液，裝入無(wú)菌試管（直徑1 cm，壁厚0.1 cm）中，使用He-Ne激光器（波長(zhǎng)為632.8 nm，光斑直徑為1.5 mm）照射，照射距離為25 cm，輸出功率為15 mW，照射時(shí)間分別設(shè)置為5、10、15、20、25和30min，原菌懸液作為空白對(duì)照組每個(gè)試驗(yàn)組均重復(fù)3次[10，11]。

3） 突變培養(yǎng)及性能檢測(cè)。用滅菌的移液管吸取1 mL各試驗(yàn)組照射后的菌懸液，移入盛有無(wú)菌水的試管中，充分振蕩混勻后進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)⑼坎加诔鹾Y平板，觀察菌落形態(tài)及菌落生長(zhǎng)，原菌懸液為空白對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。

統(tǒng)計(jì)初篩培養(yǎng)基上的平均菌落數(shù)，計(jì)算致死率[12]。若誘變后能夠生長(zhǎng)且菌落形態(tài)較大者為正突變株，反之，則為負(fù)突變株。

正變率=正突變株菌落數(shù)/誘變前菌株數(shù)×100% （1）

致死率=（對(duì)照組菌落數(shù)-處理組菌落數(shù)）/對(duì)照組菌落數(shù)×100%（2）

1.2.6 淀粉酶活性測(cè)定

1） 淀粉酶的初提。將1mL（0D值為2.1）菌液分別接種于25 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基（5%～20%的鹽濃度，pH 8.5），220 r/min，28 ℃培養(yǎng) 5 d。取 2 mL 培養(yǎng)液，6 000 r/min低溫離心10 min，上清液即作為酶的初提液，用于活性檢測(cè)[13]。

2） 淀粉酶活力測(cè)定。采用3，5-二硝基水楊酸比色（DNS）法測(cè)定淀粉酶活力[14，15]。

3） 酶活力的定義與計(jì)算。將37℃，20 min內(nèi)1mL酶初提物產(chǎn)生1μg葡萄糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位[16]。

1.2.7 野生菌株和突變株所產(chǎn)淀粉酶耐鹽性比對(duì)在產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加濃度為10%、15%、20%、25%、30%、35% 的 NaCl，并且以不含 NaCl 的發(fā)酵培養(yǎng)基作為對(duì)照，將其滅菌后，分別接入等量的突變菌株和野生菌株，發(fā)酵后測(cè)定其酶活，比較野生菌和突變株所產(chǎn)淀粉酶的耐鹽能力。

2結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)淀粉酶嗜鹽菌株分離篩選

根據(jù)a平板上菌落生長(zhǎng)情況，選出能夠生長(zhǎng)的44株菌，經(jīng)過(guò)b平板上產(chǎn)淀粉酶篩選，用盧氏碘液染色和c培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵測(cè)定其淀粉酶活力，獲得在pH 7.5時(shí)具有產(chǎn)淀粉酶的菌株5株（表1）。其中，NWU-8菌株染色圈直徑最大，為2.867 cm，染色圈直徑/菌落直徑比值最大，為2.182，酶活力最大，說(shuō)明NWU-8是產(chǎn)淀粉酶能力最強(qiáng)的菌株，挑選其作為本試驗(yàn)的出發(fā)菌株進(jìn)一步研究。

2.2形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定

NWU-8菌株在a平板上形成的菌落呈乳白色，正反面顏色相同，菌落邊緣整齊，中間有凸起，表面有皺紋，光學(xué)顯微鏡下觀察NWU-8菌株革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌體為桿狀，有芽孢，直徑小于1μm。生理生化反應(yīng)見(jiàn)表2。

2.3 16S rDNA基因序列分析

提取NWU-8菌株的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳回收擴(kuò)增序列，得到一段1484 bp長(zhǎng)度的16S rDNA，所獲序列提交Genbank（Genbank登錄號(hào)KP729620）進(jìn)行BLAST分析，通過(guò)Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。如圖1所示，發(fā)現(xiàn)NWU-8菌株與Halorubrum sp. YC-16同源性達(dá)到100%，由此可將NWU-8 菌株鑒定為 Halorubrum sp.。

2.4誘變育種結(jié)果分析

菌株NWU-8經(jīng)過(guò)He-Ne激光誘變之后突變結(jié)果如圖2所示，對(duì)比致死率與正突變率，確定菌株最佳誘變時(shí)間為20 min。反復(fù)對(duì)NWU-8菌株進(jìn)行激光誘變，將突變株點(diǎn)種到b平板上37℃恒溫培養(yǎng)7 d，用盧氏碘液染色。觀察菌落的生長(zhǎng)情況和菌落直徑、染色圈直徑的大小，比較染色圈直徑/菌落直徑的比值。挑取染色圈直徑大，染色圈直徑/菌落直徑比值大的突變株進(jìn)行液體搖瓶發(fā)酵，檢測(cè)突變株產(chǎn)淀粉酶的能力（表從表3中可以看出，NWU-8-14菌株染色圈直徑最大，為3.206 cm，單株菌落直徑較大，為1.316 cm，染色圈直徑/菌落直徑比值最大，為2.436，產(chǎn)酶活力為138 U/mL，與NWU-8菌株相比產(chǎn)酶能力提高331%，對(duì)比出發(fā)菌株NWU-8，突變株無(wú)論是從菌株直徑大小、染色圈直徑大小、染色圈直徑/菌落直徑比值以及酶活力都有較大提高，說(shuō)明高產(chǎn)突變株選育達(dá)到了試驗(yàn)?zāi)康?，可將NWU-8-14菌株作為誘變育種后的高產(chǎn)菌株。

2.5 突變株傳代培養(yǎng)檢測(cè)穩(wěn)定性

將突變株進(jìn)行50代傳代培養(yǎng)，每隔5代檢測(cè)1次菌株所產(chǎn)淀粉酶活力，結(jié)果見(jiàn)表4。經(jīng)過(guò)50代后，根據(jù)單樣本檢驗(yàn)分析，P均大于0.05，說(shuō)明各代之間產(chǎn)酶能力無(wú)顯著差異，表明NWU-8-14菌株的遺傳穩(wěn)定性較好。

2.6突變株所產(chǎn)淀粉酶耐鹽性測(cè)定將挑選出的突變株NWU-8-14和野生菌株NWU-8分別加入含有不同濃度NaCl的發(fā)酵培養(yǎng)基中，檢測(cè)菌株及所產(chǎn)淀粉酶的耐鹽度。35℃，180r/min發(fā)酵3 d后測(cè)定其酶活力，所得結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看到，野生菌NWU-8雖然能夠耐受一定濃度的鹽分，但當(dāng)鹽濃度升至25%時(shí)，所產(chǎn)淀粉酶就幾乎沒(méi)有了活性;而突變株NWU-8-14相對(duì)比親本其耐鹽能力有了較大提升，所產(chǎn)淀粉酶一直保持良好的活性，盡管在鹽濃度高達(dá)35%時(shí)，仍舊保持較好的酶活力。

3討論與結(jié)論

研究表明，嗜鹽菌所產(chǎn)的酶應(yīng)具有更廣泛的耐鹽堿特性，應(yīng)用范圍也更寬泛。其所產(chǎn)的淀粉酶比普通淀粉酶在鹽堿環(huán)境中具有更好的穩(wěn)定性。目前，有研究報(bào)道證實(shí)了此結(jié)論，主要為Bacillus subtilis[17]、Haloarcula hispanica[18]、Halobacterium halobium[19]、Halomonias meridiana [20]、B. dipsosauri [21]、B. lichenifor-mis[22]等。

本研究從定邊縣鹽湖的土壤中分離篩選出1株產(chǎn)淀粉酶的噬鹽性菌株。經(jīng)形態(tài)、生理生化及分子系統(tǒng)學(xué)研究，該菌被鑒定為Halorubrum sp.。為提高該菌株的耐鹽性和產(chǎn)淀粉酶的能力，對(duì)其進(jìn)行了He-Ne激光誘變，并選育出一株耐鹽性和產(chǎn)酶能力均明顯提升的突變株NWU-8-14，該突變株菌株對(duì)鹽濃度耐受性可達(dá)到35%;此外，其產(chǎn)酶活力達(dá)到138 U/mL，產(chǎn)酶能力大大提高，且經(jīng)過(guò)50代傳代檢測(cè)，菌株遺傳穩(wěn)定性良好。

參考文獻(xiàn)：

[1]畢靜，薛茂云，楊?lèi)?ài)萍，等.利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)中溫淀粉酶發(fā)酵條件的優(yōu)化研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2014， 39（9）： 49-51.

[2]張寧，蔣劍春，李翔宇，等.我國(guó)非糧燃料乙醇產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及前景展望[J].生物質(zhì)化學(xué)工程，2011，45（4）： 47-50.

[3]李欣，張麗萍，程輝彩，等.耐低溫兼性厭氧淀粉酶產(chǎn)生菌Y89的篩選及酶學(xué)特性[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（7）： 107-111.

[4]張麗靖，沈江鋒，金慶超，等.一株酸性淀粉酶產(chǎn)生菌的分離、鑒定及酶學(xué)特性初步研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2011 （5） ： 142-145.

[5]胡建恩，曹茜，楊帆，等.耐高溫α-淀粉酶高密度高表達(dá)發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2012， 33（1）： 219-225.

[6]左雪枝，方華舟.牛糞堆肥中高效菌株的篩選與應(yīng)用效果[J].中國(guó)土壤與肥料，2014（1）： 95-100.

[7]周德慶.微生物學(xué)試驗(yàn)手冊(cè)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986.

[8] KRIEG R N， HOLT J G. Bergeyp's manual of determinalive bacteri-ology [M ]. Baltimore ： Williams & Wilkins， 1994.

[9]TAMURAK， DUDLEY J， NEIM， et al. MEGA4： Molecular evolu-tionary genetics analysis （MEGA） software version 4.0[J]. Molecu-lar biology and evolution， 2007， 24（8） ： 1596-1599.

[10] 付瑞敏，韓鴻鵬，張麗琴，等.葡萄霜霉病和白粉病拮抗菌的分離、鑒定和He-Ne激光誘變[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013， 41（8）：122-125.

[11] 郭愛(ài)蓮，朱宏莉.紫外、氦氖激光等復(fù)合誘變產(chǎn)果膠酶細(xì)菌ZH-1 的研究[J].光子學(xué)報(bào)，2002， 31（ 11）： 1335-1339.

[12]鞏潔，陳亮，陳立，等.紫外線、He-Ne激光對(duì)葡萄白腐病菌拮抗菌PT2的復(fù)合誘變效應(yīng)[J].植物保護(hù)，2010， 36（5）：105-109.

[13] PRAKASH B， VIDYASAGAR M， ADHUKUMAR M S， et al. Pro-duction ，purification，and characterization of two extremely halo-tolerant thermostable， and alkali-stahle a-amylases from Chromo-halobaacter sp.Lj J. Process biochemistry， 2009， 44（2）： 210-215.

[14] 寧正祥.食品成分分析手冊(cè)[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1998.

[15]劉賀紅，萬(wàn)金泉，馬邕文，等.DNS比色法測(cè)定污泥中淀粉酶活性的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008， 36（33） ： 14369-14371.

[16] 張繼千，吳波，鄭冰心，等.海洋菌W11產(chǎn)中溫淀粉酶的酶學(xué)特性[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010， 29 （1）： 71-74.

[17] YANDRI S T， HADI S. Purification and characterization of extra-cellular a -amylase enzyme from locale bacteria isolale Bacillussubtilis ITBCCB148[J]. Eur J Sci Res， 2010， 39 （1） ： 64-74.

[18]HUTCHEON G W， VASISHT N， BOLHUIS A. Characterizationof a highly stable α-amylase from the halophilic archaeon Haloar-cula hispanica [J]. Extremophiles，2005， 9 （6）： 487-495.

[19] PATEL S， JAIN N， MADAMWAR D. Production of α-amylasefrom Halobacterium halobium [J]. World journal of microbiology &biotechnology， 1993， 9 （ 1） ：25-28.

[20] CORONADO M J， VARGAS C， HOFEMEISTER J，et al. Produc-tion and biochemical characterization of an α-amylase from themoderate halophile Halomonas meridiana [J]. FEMS microbiologyletters， 2000，183 （l）： 67-71.

[21] DEUTCH C E. Characterization of a salt tolerant extracellular a-amylase from Bacillus dipsosauri [J]. Lett Appl Microhiol，2002，35 （1）： 78-84.

[22] MACHIUS M， WIEGAND G， HUBER R. Crystal structure of calci-um depleled Bacillus licheniformis α-amylase al 2.2 A resolution [J].Journal of molecular biology， 1995，246 （4）：545-559.

收稿日期：2019-11-10

基金項(xiàng)目：甘肅省高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升項(xiàng)目（2019B-203）

作者簡(jiǎn)介：張偉（1984-），男，甘肅慶陽(yáng)人，講師，主要從事微生物物種資源研究，（電話）18293373738（電子信箱）274591224@qq.com;通信作者，周曉倫，講師，主要從事土壤微生物研究，（電子信箱）610253095@qq.com。