吡格列酮對豬卵母細胞體外成熟及孤雌胚胎發育的影響

呂玲燕 汪燕玲 潘星辰

摘要：為探討吡格列酮（PIO）對豬卵母細胞體外成熟及孤雌胚胎發育的影響，比較了不同濃度PIO對卵母細胞的體外成熟狀況以及孤雌胚胎體外發育潛能的影響。結果表明，成熟培養液中添加1.0 μmol/L PIO組的極體排出率顯著高于0.5 μmol/L添加組（P<0.05），極顯著高于對照和1.5 μmol/L添加組（P<0.01）。對在4種PIO濃度中培養成熟的卵母細胞進行孤雌激活，結果表明，添加1.0 μmol/L PIO組的卵裂率顯著高于0.5 μmol/L添加組（P<0.05），極顯著高于對照和1.5 μmol/L添加組（P<0.01）;就囊胚率及細胞總數而言，1.0 μmol/L PIO添加組極顯著高于對照、0.5、1.5 μmol/ L這3個PIO添加組（P<0.01），表明成熟培養液中添加1.0 μmol/L PIO有助于提高豬卵母細胞的成熟率，以及孤雌胚胎的囊胚率和囊胚細胞總數。

關鍵詞：吡格列酮;豬;卵母細胞;孤雌胚胎;發育效果

中圖分類號：S828;Q954.4 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）17-0093-04

Abstract： Aiming to investigate the effects of pioglitazone（PIO） on oocytesmaturation in vitro and parthenogenetic embryos development of pig， the effect of different concentration PIO on oocytes maturation in vitro and parthenogenetic embryos developmental potency were compared. The results showed that the polar body excretion rate of 1.0 μmol/L PIO-treated group was significantly higher than that of 0.5 μmol/L PIO-treated group in maturation medium（P<0.05），was very significantly higher that of control an 1.5 μmol/L PIO-treated group（P<0.01）. The mature oocytes cultured in different concentrations PIO were parthenogenetic activated， the experimental results showed that the cleavage rate of the 1.0 μmol/L PIO group was significantly higher than of the 0.5 μmol/L group in embryo ?culture medium（P<0.05）， was very significantly higher than that of the control and 1.5 μmol/L PIO group （P<0.01）， as for the blastocyst rate and the total number of cells， the group of the 1.0 μmol/L PIO-treated group was the highest among the groups （P<0.01）. ?In conclusion， 1.0 μmol/L PIO in maturation medium could improve the maturation rate of porcine oocyte， also could significantly improve the blastocyst rate and the total number of cells of porcine parthenogenetic embryos.

Key words： pioglitazone; pig;oocytes; parthenogenetic embryos; developmental effect

豬胚胎工程的發展極大地推進了畜牧業和醫學的進程，通過它可以改良品種、培育抗病豬種提高肉質、生產轉基因豬或基因組修飾豬、制備人類疾病模型、進行器官移植、生產藥物蛋白、研究發育機理等[1]。胚胎的體外培養是豬胚胎工程的主要環節之一，無論是孤雌激活、體外受精（IVF） 、核移植技術還是基因打靶、基因敲除技術，所生產的胚胎都要經過體外培養，發育到適當的階段才能進行后續的研究，然而后續的胚胎發育過程都離不開前期卵母細胞的成熟培養。豬的卵母細胞與其他物種的卵母細胞相比，其含有較豐富的脂肪滴[2]，脂肪滴作為一種特殊的細胞器，廣泛存在于各種細胞中尤其是脂肪細胞中[3，4]。Goodman[5]、Brown[6]研究表明脂肪滴是一種存儲能量、調節脂質動態平衡及細胞內信號傳導的重要細胞器，Kikuch等[7]研究表明脂肪滴在卵母細胞成熟和早期胚胎發育過程中具有重要的作用。目前學者對卵母細胞和早期胚胎發育過程中關于脂質合成、沉積、代謝等方面的研究相對較少，因此本試驗首次加入吡格列酮（PIO，治療糖尿病藥物），探索添加PIO對豬卵母細胞脂質的合成、代謝、沉積等方面的影響，以及PIO對豬卵母細胞成熟狀況及孤雌胚胎早期發育的影響，為更好地提高體外生產（IVP）豬胚胎的囊胚發育率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和器材

胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司，TCM-199粉劑、DMEM粉劑購自美國Gbico公司，激素eCG、hCG購自美國Sigma公司，其余的化學試劑如無特殊說明均購自美國Sigma Aldrich公司。配制溶液的水均為dd H2O。

試驗器材有：實體顯微鏡（日本NIKON）、CO2培養箱（Thermo Life Science）、細胞融合儀（型號：ECM2001）、融合槽（型號：BTX 450）、卵母細胞成熟培養皿（35 mm及60 mm塑料平皿）、胚胎培養皿（四孔板）。

1.2 試驗方法

1.2.1 卵母細胞的成熟培養 豬的卵巢來源于南寧市屠宰場，裝入含有雙抗（青霉素、鏈霉素）25～35 ℃的生理鹽水中，用保溫壺4 h之內送回實驗室。取卵巢表面2～6 mm的卵泡，試管中靜置，棄去上清，留沉淀部分分裝。挑選含有3層及以上有顆粒，卵丘細胞包被、折光性良好的卵丘卵母細胞復合體（COCs），放入成熟液中（含10 IU/mL hCG+10 IU/mL eCG）培養，將卵母細胞隨機分成4組：第一組為空白對照組;第二組添加0.5 μmol/L PIO;第三組添加1.0 μmol/L PIO;第四組添加1.5 μmol/L PIO，20～22 h后換成不含激素的培養液，繼續培養18～20 h至細胞成熟。

1.2.2 孤雌胚胎的激活、培養以及囊胚細胞計數 將在不同濃度PIO中培養的成熟卵母細胞進行孤雌激活，參數為：125 V/mm，80 μs，1 DC，激活液成分為0.3 mol/L甘露醇+0.1 mmol/L MgSO4+0.1 mmol/L CaCl2+0.01% PVA（聚乙烯醇）。激活完成后，將激活后的孤雌胚胎放入PZM-3（胚胎培養液-3）中培養，胚胎標記為4組，分別為對照組（CK）、0.5 μmol/L PIO組、1.0 μmol/L PIO組、1.5 μmol/L PIO組。48 h后觀察卵裂率，160～168 h后觀察囊胚率。在培養的第6至第7天收集囊胚，置于Hoechst33342染液中，石蠟-凡士林封片，熒光顯微鏡下觀察記錄囊胚細胞的總數目。

1.3 統計分析

試驗數據用SPSS 17.0軟件進行統計分析，所有試驗4次重復。

2 結果與分析

2.1 不同濃度PIO對卵母細胞體外成熟效率的影響

從表1可以看出，在卵母細胞的成熟培養液中添加不同濃度的PIO，培養40～44 h后，添加1.0 μmol/L PIO組的極體排出率最高，顯著高于對照和1.5 μmol/L PIO組。卵母細胞成熟液中添加1.0 μmol/L PIO能顯著促進卵母細胞第一極體的排出;從圖1可以看出，卵母細胞成熟液中添加1.0 μmol/L PIO能顯著促進卵母細胞的成熟發育。

2.2 成熟培養液中不同濃度PIO對孤雌胚胎發育效果的影響

對在不同濃度PIO中培養成熟的卵母細胞進行孤雌激活，培養160～168 h。試驗結果（表2）表明，添加1.0 μmol/L PIO組的卵裂率顯著高于對照和1.5 μmol/L PIO添加組;就囊胚率及細胞總數而言，1.0 μmol/L PIO添加組顯著高于其他3個處理;試驗結果（圖2）表明，1.0 μmol/L PIO中培養成熟的卵母細胞進行孤雌激活后的胚胎發育良好，經Hoechst 33342染色后的囊胚細胞數目顯著增加。

3 小結與討論

優化培養體系對于卵母細胞的體外成熟以及后續胚胎發育至關重要[8]。大多學者認為代謝異常能減低卵母細胞在體外培養的成熟率以及胚胎的發育能力。因此研究者們[9， 10]通過在培養體系中改變溫度、補充各類生長因子、活化劑、抗氧化劑等途徑來改善卵母細胞的成熟和胚胎的發育。豬的卵母細胞和胚胎與其他物種的相比，其含有較豐富的脂肪滴[2]，正是由于它的內脂質含量較高，從而為人們更好地了解卵母細胞在成熟過程中脂質和脂肪酸代謝提供了一種很好的模型。Dunning等[11]、Gardner等[12]研究表明，脂質代謝通過脂肪酸氧化途徑在線粒體中產生能量物質ATP。而Guan等[13]、Sanchez-Lazo等[14]研究則表明，脂肪酸的合成和氧化對促進卵母細胞成熟和胚胎發育是必不可少的。在體外成熟過程中，脂肪酸氧化下調能減少小鼠胚胎的增殖[15]以及擾亂牛胚胎的發育[16]。因此， 脂質代謝的調節對于改善哺乳動物卵母細胞體外成熟和胚胎發育具有重要的意義。

PIO是一種抗糖尿病和高血糖的藥物，屬于噻唑烷二酮家族，尤其是對2型糖尿病效果顯著。Phongnimitr等[8]、Wang等[17]研究表明，PIO也是一種PPARG激動劑，通過調節兔、牛體內活性氧、谷胱甘肽和酶的活性來防止氧化應激。此外，Bogacka等[18]研究結果表明，PIO能通過改變碳水化合物和脂質代謝相關基因的表達從而促進脂肪細胞中的脂質沉積和增強β氧化反應。然而PIO對豬卵母細胞體外成熟以及后續胚胎發育的影響鮮有相關報道。

因此本試驗試圖探索添加PIO對豬卵母細胞體外成熟的影響，以及對孤雌胚胎早期發育的影響。試驗結果表明，與對照相比，成熟培養液中添加不同濃度的PIO均能有效提高豬卵母細胞的成熟率，其中1.0 μmol/L PIO效果最好;添加1.0 μmol/L PIO還能顯著提高豬孤雌胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚細胞總數。Sang-Gi等[19]研究結果表明，用1.0 μmol/L PIO處理體外成熟的卵母細胞，通過在卵母細胞中提高脂質代謝和抗氧化應激，從而促進卵母細胞的成熟以及改善后續孤雌胚胎的發育、增加孤雌胚胎的囊胚細胞數，本試驗的研究成果與Sang-Gi等[19]得出的結論相一致。Song等[20]研究結果表明，用50 μmol/L PPARG激動劑羅格列酮（Rosiglitazone）處理體外成熟的卵母細胞能顯著增加其成熟率，本試驗中添加的PIO（同屬于噻唑烷二酮家族）也具有相同的作用。徐禮杰等[21]研究結果表明，抗氧化物質PIO可促進小鼠胚胎發育，有效克服胚胎體外2-細胞發育阻滯現象，本試驗的研究結果與徐禮杰等[21]得出的結論相一致。至于PIO促進卵母細胞體外成熟以及孤雌胚胎發育、增加孤雌囊胚細胞數的具體作用機制還有待進一步研究。

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