三種莢蒾中香豆素提取工藝及含量比較分析研究

牛茵茵 廖騰飛 王麗

摘要：以皺葉莢蒾（Viburnum rhytidophyllum）、球核莢蒾（Viburnum propinquum）和雞樹條莢蒾（Viburnum sargentii）為原料，選取乙醇濃度、提取時間、提取溫度和料液比為因素，吸光度為指標進行單因素試驗，選取適當因素水平進行正交試驗，并采用高效液相色譜法（HPLC）進行試驗，采用優化后的工藝進行提取，比較3種莢蒾（Viburnum dilatatum）中香豆素的提取率。結果表明，3種莢蒾中均含有香豆素，其中，皺葉莢蒾中香豆素的含量最高，球核莢蒾次之，雞樹條莢蒾最少;皺葉莢蒾和球核莢蒾香豆素最佳提取條件為乙醇濃度55%、提取時間60 min、提取溫度80 ℃、料液比1∶25（g∶mL）;雞樹條莢蒾香豆素最佳提取條件為乙醇濃度55%、提取時間80 min、提取溫度70 ℃、料液比1∶25（g∶mL）。不同品種莢蒾中香豆素的提取工藝和所提取的香豆素含量均存在差異。

關鍵詞：莢蒾（Viburnum dilatatum）;香豆素;提取優化;測定比較

中圖分類號：R284.2 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）17-0107-05

Abstract： The raw materials are Viburnum rhytidophyllum，Viburnum propinquum and Viburnum sargentii. The single factor experiment was carried out by selecting ethanol concentration， extraction time， extraction temperature and ratio of material to liquid as factors， absorbance as index， and then orthogonal test analysis was carried out at appropriate factor level and HPLC was used to carry out the experiment. The yield of coumarin from three varieties of Viburnum was compared by the optimized extraction process. The results showed that coumarin was found in all three kinds of Viburnum， Viburnum rhytidophyllum was the highest，Viburnum propinquum was the second， and Viburnum sargentii was the least. The optimum conditions of Viburnum rhytidophyllum ?and Viburnum propinquum were as follows： The concentration of ethanol was 55%， the extraction time was 60 min， the extraction temperature was 80 ℃， and the ratio of material to liquid was 1∶25. The optimum conditions of Viburnum sargentii were as follows： The concentration of ethanol was 55%， the extraction time was 80 min， the extraction temperature was 70 ℃， and the ratio of material to liquid was 1∶25. The content of coumarin was different in the extraction process of different varieties of Viburnum.

Key words： Viburnum dilatatum; coumarin; extraction optimization; comparison of measurements

莢蒾屬（Viburnum）植物在中國廣泛分布，且西南部地區資源尤為豐富，一直以來都是重要的中藥材。莢蒾屬植物種類繁多且多數處于野生狀態，具有抗塵埃和富集重金屬能力，在適宜的園林中廣為應用[1-3]。在現代研究中發現莢蒾（Viburnum dilatatum）有極高的藥用和經濟價值，其中有9種莢蒾的根、莖、葉及花果均可入藥，且莢蒾中的有機成分具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等功效[4-8]。值得關注的是，莢蒾中的氨基酸和微量元素的營養價值較高且具有止咳療效[9-12];其果實可用來制作果醬、飲品和釀酒，樹皮纖維可制成繩索，因此，莢蒾的開發和應用非常有前景。莢蒾中主要含有多種天然活性物質，如類黃酮、糖類、酚類、香豆素和果皮紅色素。已有研究對莢蒾中的黃酮、多糖、葉綠原酸和果皮紅色素等天然活性物質進行了測定并提取分析[13-15]，但尚未見到莢蒾中香豆素天然活性物質的提取研究。

本研究以莢蒾屬植物中球核莢蒾（Viburnum propinquum）、皺葉莢蒾（Viburnum rhytidophyllum）和雞樹條莢蒾（Viburnum sargentii）為研究對象，對這3種莢蒾葉中香豆素的含量進行測定并優化提取，同時對其葉中香豆素的含量差異進行比較分析，以期為保健品和化妝品提供更多的天然原料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皺葉莢蒾和球核莢蒾均采自湖北省恩施市土家族苗族自治州，北緯30°18′47″，東經109°16′4″，海拔1 420 m;雞樹條莢蒾采自湖北省恩施市土家族苗族自治州，北緯30°3′7″，東經109°6′53″，海拔1 130 m;香豆素標準品（CAS RN為91-64-5，純度98%），購自成都埃法生物科技有限公司;無水乙醇（分析純），購自北京化工廠;乙腈（色譜純），購自科隆化學品有限公司;試驗用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

高速萬能粉碎機（RT-02A），中誠藥機;電子天平（BSA224S），賽多利斯科學儀器（北京）有限公司;電熱鼓風干燥箱（RT-02A），上海市博遠實業有限公司醫療設備廠;低速大容量離心機（DL-5-B），上海安亭科學儀器廠;超聲波清洗器（KQ5200E），昆山市超聲儀器有限公司;循環水式多用真空泵（SHB-III），鄭州長城科貿有限公司;高效液相色譜儀（LC7050），海能儀器股份有限公司;雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901），北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 高效液相色譜法（HPLC）測定條件 Ultimate AQ-C18 （4.6 mm × 250 mm，5 μm），柱溫35 ℃，流動相乙腈與去離子水體積比為45∶55，流速 ? ? ?1.0 mL/min，檢測波長275 nm，進樣量5 μL。

1.3.2 供試品溶液的制備 選擇新鮮的莢蒾葉，首先置于50 ℃恒溫干燥箱內烘干，之后將干燥的莢蒾葉碎成粉末，然后過60目篩，稱取干燥至恒重的莢蒾葉粗粉約5.00 g置于錐形瓶中，并放入超聲波清洗器中超聲30 min，分別在不同時間、不同濃度、不同料液比和不同溫度條件下進行乙醇水浴提取，離心后低溫保存。

1.3.3 標準溶液的制備 精密稱取香豆素標準品3.5 mg，加乙腈（色譜純）定容至100 mL，即得濃度為35 μg/mL的香豆素標準溶液。分別吸取2、4、6、8 mL濃度為35 μg/mL的標準溶液于10 mL的容量瓶中，用乙腈（色譜純）定容，分別配成7、14、21、28 μg/mL的香豆素系列標準溶液。

1.3.4 3種莢蒾中香豆素吸光度值的測定 將所提取的3種莢蒾中香豆素稀釋成不同濃度的待測液，用紫外分光光度計測定吸光度值，比較單因素中提取時間、乙醇濃度、料液比、提取溫度3個水平的吸光度值大小。

1.3.5 標準曲線的建立 在275 nm的波長條件下測定香豆素系列標準溶液，以標準溶液濃度X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標作標準曲線，得到線性方程Y=13.789X-4.308 5，R2 =0.999 6（圖1）。

1.3.6 單因素試驗

1）乙醇濃度。稱取干燥至恒重的莢蒾葉粉末約5.00 g于錐形瓶中，置于超聲波清洗器中30 min后進行水浴加熱提取，在乙醇濃度分別為15%、35%、55%、75%、95%，料液比為1∶25（g∶mL，下同），提取溫度為70 ℃，提取時間為70 min的條件下制備供試品溶液，采用紫外分光光度計測定樣品吸光度，研究不同乙醇濃度對吸光度的影響。

2）提取時間。稱取干燥至恒重的莢蒾葉粉末約5.00 g于錐形瓶中，置于超聲波清洗器中30 min后進行水浴加熱提取，在提取時間分別為40、50、60、70、80 min，料液比為1∶25，提取溫度為70 ℃，乙醇提取濃度為75%的條件下制備供試品溶液，采用紫外分光光度計測定樣品吸光度，研究不同提取時間對吸光度的影響。

3）提取溫度。稱取干燥至恒重的莢蒾葉粉末約5.00 g于錐形瓶中，置于超聲波清洗器中30 min后進行水浴加熱提取，在提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，料液比為1∶25，提取時間為70 min，乙醇提取濃度為75%的條件下制備供試品溶液，采用紫外分光光度計測定樣品吸光度，研究不同提取溫度對吸光度的影響。

4）料液比。稱取干燥至恒重的莢蒾葉粉末約5.00 g于錐形瓶中，置于超聲波清洗器中30 min后進行水浴加熱提取，在料液比分別為1∶10、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50，提取溫度為70 ℃，提取時間為70 min，乙醇提取濃度為75%的條件下制備供試品溶液，采用紫外分光光度計測定樣品吸光度，研究不同料液比對吸光度的影響。

1.3.7 正交試驗及含量測定 在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，以莢蒾中總香豆素提取率為考察指標，采用L9（34）正交試驗設計，選取提取香豆素的最佳條件（表1）。

將正交試驗制備的樣品溶液吸取約1 mL經0.45 μm有機微孔濾膜過濾，裝樣進行香豆素含量的測定，香豆素的提取率公式如下：

[α=X×VM×10-5×100%] ? （1）

式中，α 表示香豆素的提取率，X表示樣品液中香豆素的質量濃度（μg/mL），V表示提取液的總體積（mL），M表示莢蒾葉的取樣質量（g）。

1.3.8 驗證試驗及含量比較 對正交試驗分析得出的最優組合進行驗證。按照3種莢蒾品種分析得到的最優試驗條件對樣品中香豆素進行提取測定，分析計算香豆素的提取率，并在此基礎上比較3種莢蒾中香豆素含量的差異。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

分別在不同乙醇濃度、不同提取時間、不同提取溫度和不同料液比4種因素條件下，對提取3種莢蒾中香豆素溶液吸光度的影響進行研究分析，結果如圖2至圖5所示。

由圖2可知，皺葉莢蒾和球核莢蒾中香豆素提取液的吸光度最大對應的乙醇濃度為55%，在此之前，吸光度隨著乙醇濃度的增大而增大，當乙醇濃度大于55%時，吸光度開始減小，說明在試驗范圍內，皺葉莢蒾和球核莢蒾的最佳乙醇提取濃度為55%;而雞樹條莢蒾中香豆素提取液的吸光度呈先增大后減小、再增大、再減小的趨勢，其最佳乙醇提取濃度為35%。可能原因是當乙醇濃度達到一定程度時，對香豆素的分子結構會造成不同程度的影響。

由圖3可知，當提取時間在40～60 min時，香豆素提取液的吸光度隨時間的延長而增大，當提取時間超過60 min 時，繼續延長提取時間，3種莢蒾中香豆素提取液的吸光度反而減小，可能原因是長時間的超聲機械作用使香豆素分子的某些鍵斷裂，從而破壞分子，考慮到時間越長提取成本越高，所以提取時間宜選60 min。

由圖4可知，溫度對皺葉莢蒾和雞樹條莢蒾中香豆素提取液的吸光度影響不大，而對球核莢蒾中香豆素提取液的吸光度影響呈先增大后減小的趨勢，產生這一現象的原因可能是高溫破壞了香豆素的結構。

由圖5可知，料液比對3種莢蒾中香豆素提取液吸光度的影響明顯。吸光度隨著料液比的增大而不斷增大，但當料液比大于1∶25時，吸光度隨料液比的增大而減小，因此，為了節約物料成本，選取料液比為1∶25提取較為合適。

2.2 正交試驗結果與分析

分別取皺葉莢蒾、球核莢蒾和雞樹條莢蒾各5.00 g，每個品種各取9份，按因素水平表采用超聲輔助水浴協同提取3種莢蒾的香豆素，以提取率作為考察指標進行正交試驗，取平均值，結果見表2。極差R反映各因素對試驗結果的影響，極差R越大，表示該因素對提取率的影響越大。根據K分析各因素水平對提取率的影響，K越大，表示因素水平對提取率影響越大，由此可得影響3種莢蒾提取香豆素的因素大小和最優提取組合。結果表明，皺葉莢蒾和球核莢蒾中香豆素的最佳提取條件為乙醇濃度55%、提取時間60 min、提取溫度80 ℃、料液比 ? 1∶25;雞樹條莢蒾中香豆素的最佳提取條件為乙醇濃度55%、提取時間80 min、提取溫度70 ℃、料液比1∶25。影響皺葉莢蒾提取香豆素的因素大小表現為乙醇濃度>料液比>提取時間>提取溫度;影響球核莢蒾提取香豆素的因素大小表現為乙醇濃度>提取時間>料液比>提取溫度;影響雞樹條莢蒾提取香豆素的因素大小表現為提取時間>料液比>乙醇濃度>提取溫度（表3）。

2.3 驗證試驗及含量比較結果與分析

按照3種莢蒾提取香豆素的最優組合進行3次平行驗證，由表4可知，3種莢蒾的最優組合均能提取香豆素，但3種莢蒾所提取的香豆素含量差異較大，皺葉莢蒾中香豆素的含量最高，球核莢蒾次之，雞樹條莢蒾最少。

3 小結

通過單因素試驗分別探索了提取時間、提取溫度、料液比和乙醇濃度4個因素對莢蒾中香豆素提取率的影響，并在此基礎上設計了正交試驗，優化3種莢蒾中香豆素的提取工藝，對比分析不同品種、不同提取工藝的香豆素提取率。結果表明，皺葉莢蒾和球核莢蒾中香豆素的最佳提取條件為乙醇濃度55%、提取時間60 min、提取溫度80 ℃、料液比1∶25;雞樹條莢蒾中香豆素的最佳提取條件為乙醇濃度55%、提取時間80 min、提取溫度70 ℃、料液比1∶25。3種莢蒾中均含有香豆素，其中，皺葉莢蒾中香豆素的含量最高，球核莢蒾次之，雞樹條莢蒾最少。

不同品種莢蒾中香豆素的提取工藝和含量存在差異，本研究為其他品種莢蒾中香豆素的含量測定和提取工藝奠定了基礎。未來可收集不同地區的莢蒾屬品種，分析地區差異性對香豆素含量的影響，并對莢蒾屬中香豆素的結構進行分析鑒定，建立莢蒾屬香豆素高效液相特征圖譜，以期為莢蒾屬研究提供參考。

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