應用iTRAQ技術快速鑒定稻米品質差異蛋白的方法分析

閘雯俊 游艾青

摘要：以鄂中5號和桂朝2號為材料，應用iTRAQ技術快速鑒定稻米品質差異蛋白，從而根據差異蛋白快速和有效地篩選到與水稻（Oryza sativa L.）品質相關聯的候選基因。結果表明，鄂中5號、桂朝2號共鑒定出水稻顯著差異蛋白61個，其中上調蛋白21個，下調蛋白40個。該技術可廣泛應用于水稻品質性狀的研究和開發并且結合轉基因技術培育高檔優質水稻品種。

關鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）;iTRAQ技術;差異蛋白;鑒定

中圖分類號：S511 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）17-0175-03

Abstract： Using Ezhong No. 5 and Guichao No. 2 as materials， the iTRAQ technology was used to quickly identify rice quality differential proteins， so that candidate genes related to rice quality can be rapidly and effectively screened based on the differential proteins. The results showed that Ezhong No. 5 and Guichao No. 2 identified a total of 61 significantly different proteins in rice， including 21 up-regulated proteins and 40 down-regulated proteins. This technology can be widely used in the research and development of rice quality traits and combined with transgenic technology to cultivate high-quality rice varieties.

Key words： rice（Oryza sativa L.）; iTRAQ; differential protein; identify

水稻（Oryza sativa L.）是世界主要糧食作物之一，全球超過一半人口都以水稻作為主食。估計到2025年，世界水稻產量要比現在增長60%才能夠滿足需要。中國是水稻生產大國，水稻常年種植面積約 ? ? ? 3 000萬hm2，占世界水稻種植總面積的1/4。因此，水稻的種植安全與中國經濟發展和人民生活密不可分。

目前公認的高檔優質稻是指稻米的理化品質優異、米粒細長、外觀晶瑩透明、適口性好、商品價位高、可與泰國香米相媲美的一類水稻品種。試驗表明，優質稻的直鏈淀粉含量為13%～17%，膠稠度65～85 mm，長寬比3.4以上。高檔優質稻的理化指標與國標不完全一致，高檔優質稻品種在注重精米理化指標的同時，更注重外觀品質和適口性，做到好看更好吃。而湖北省高檔優質稻種植面積一直徘徊在6萬 hm2 左右，僅占水稻種植面積的3% ，高檔優質稻產業化開發明顯滯后，與市場需求不相適應[1，2]。

同位素相對和絕對定量標記（Isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）是最近發展起來的一種新型定量蛋白質組學技術，但目前尚未發現用于快速鑒定稻米品質差異蛋白質組學研究的報道。利用iTRAQ這一高通量、準確的蛋白質組學研究手段來研究與水稻品質相關的候選基因，可廣泛應用于水稻品質性狀的研究和開發并且結合轉基因技術培育高檔優質水稻品種。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻品種為鄂中5號和桂朝2號子粒。

1.2 方法

1.2.1 iTRAQ標記 采用丙酮沉淀法提取處理組與對照組水稻子粒蛋白質。對提取后的蛋白質樣品進行還原烷基化處理，用考馬斯亮蘭法測定蛋白質濃度，經SDS-PAGE檢測后取等量蛋白質樣品Trypsin酶解，用iTRAQ 117、iTRAQ 115 標記鄂中5號蛋白質，iTRAQ 113、iTRAQ 119標記桂朝2號蛋白質，最后將標記好的4組樣品等量混合，應用強陽離子交換色譜法對混合后的肽段進行預分離，隨后再進行液相分離和質譜分析。

1.2.2 差異蛋白的選擇 如果某個蛋白的差異倍數（Fold change）>1.20或<0.83，同時經過統計檢驗，P<0.05便可認為是差異蛋白[3]。

1.2.3 生物信息學分析 對質譜檢測結果進行數據查庫、定量分析的過程：用ProteinPilot軟件的Paragon算法進行肽段、蛋白鑒定和定量，檢索數據庫為NCBI水稻種屬非冗余數據庫。搜索參數設置為胰蛋白酶，全酶切方式，最大漏切位點為2，固定修飾為半胱氨酸的甲基甲基硫代甲砜烷基化，可變修飾為甲硫氨酸的氧化，肽段N端和賴氨酸的iTRAQ修飾;為降低假陽性結果，蛋白鑒定標準設定為ProtScore≥1.3，同時最少使用2條置信度≥ 95%的肽段進行蛋白定量;結果經自動偏離校正以便消除標記樣品混合時引入的誤差。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測差異蛋白基因 取-80 ℃保存的水稻總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄獲得cDNA。在 Roteogene 6000TM 定量PCR儀上進行10 μL體系的 PCR 反應，反應條件如下： 94 ℃ 預變性2 min，以30～40 個循環進行 PCR 擴增（94 ℃變性 20 s，55 ℃ 退火 15 s，72 ℃延伸 20 s），每個樣品 3 個重復，取平均值。采用 2-ΔΔCt 方法比較不同樣品基因表達水平。

2 結果與分析

2.1 GO功能顯著富集結果

所有被鑒定蛋白質編碼基因的GO功能顯著富集，質譜鑒定蛋白質的GO功能產物屬性顯著富集（-logP≥1.5）在細胞組分中，包括細胞、細胞部分、細胞器、膜、細胞器部分、膜部分、大分子復合體、細胞外區域、膜封閉腔、細胞外區域部分（圖1）;其次，GO功能產物屬性顯著富集（-logP≥1.5）在分子功能中，包括催化活性、結合活性、分子功能調節子、結構分子活性、營養庫活性、分子傳感器活性、抗氧化活性、轉運活性（圖2）;最后，GO功能產物屬性顯著富集（-logP≥1.5）在生物過程中，包括代謝過程、細胞過程、單組織過程類別、對刺激的反應、細胞成分組織或生物發生、生物調節、定位、生物過程調節、信號、解毒、多細胞組織過程、發育過程、繁殖、多生物過程、生殖過程（圖3）。

2.2 蛋白質的鑒定及定量

鑒定出水稻鄂中5號/桂朝2號（E5/G2）的顯著差異蛋白61個，其中上調蛋白21個，下調蛋白40個（圖4）。

2.3 差異表達蛋白質的功能注釋及其分類

所有具有高度同源性的差異表達蛋白被分配到16個COG類別（圖5）。其中，僅限一般功能預測類蛋白（7個）代表最大的功能類別，其次有6個蛋白參與碳水化合物轉運和代謝、5個蛋白參與能量生產和轉化和5個蛋白參與翻譯、核糖體結構和生物發生。3個蛋白參與RNA加工和修飾，3個蛋白參與翻譯后修飾、蛋白質轉換、伴侶，2個蛋白屬于功能未知、2個蛋白參與氨基酸轉運和代謝，2個蛋白參與無機離子轉運和代謝、2個蛋白參與細胞內轉運、分泌和囊泡轉運，2個蛋白參與次生代謝產物的生物合成、轉運和分解代謝。參與細胞壁/膜/包膜生物發生、防御機制、信號轉導機制、核苷酸轉運和代謝及脂質轉運和代謝的蛋白均只有1個。

3 小結與討論

本研究共篩選到 61個水稻差異表達蛋白，功能分析表明其主要集中于細胞組分、分子功能、生物過程。在細胞組成方面主要分布于細胞和細胞部分，分子功能主要涉及催化活性和結合活性，生物過程主要涉及細胞過程和代謝過程。采用 iTRAQ 技術的水稻定量蛋白質組學研究方法，有效地篩選到與水稻品質相關聯的候選基因;同時可廣泛應用于水稻品質性狀的研究和開發并且結合轉基因技術來培育高檔優質水稻品種。

參考文獻：

[1] 陳柏槐. 湖北省優質水稻現狀與發展思路 [J]. 中國稻米， 2004（5）：12-15.

[2] 李芙蓉，聶練兵，凌 高. 湖北省優質水稻生產現狀與發展思路 [J]. 安徽農業科學，2006， 34（19）：5059-5061.

[3] ZHAO Y L， ZHOU Y H， CHEN J Q， et al. Quantitative proteomic analysis of sub-MIC erythromycin inhibiting biofilm formation of ? S. suis in vitro[J]. Journal of proteomics， 2015，116： 1-14.