婦女孕早期炎性標志物NLR與母乳中sIgA的關系

劉麗軍 郭倩穎 崔銘萱 劉菊芬 楊晨 李雪寧 柳鵬 王琳琳

母乳成分復雜，不僅可以滿足嬰兒的營養需求，還可以提供保護成分，以助于嬰兒腸道發育和免疫系統發育成熟。母乳中有多種免疫調節成分，這些成分對于嬰兒建立先天免疫力和發展適應性免疫力至關重要。另外，它在變態反應的預防或發展中可能也發揮一定作用[1]。其中，分泌性免疫球蛋白(secretory Immunoglobulin A，sIgA)因含量豐富，功能顯著而備受關注。當病原體進入母親的腸道或上呼吸道時，派伊爾氏淋巴結獲得病原體，其抗原由M細胞呈遞至循環的B細胞，然后再向乳腺上皮細胞的漿膜側遷移，并產生IgA。隨著IgA從乳腺上皮細胞的漿膜側移至腔(頂)側，它們被糖基化并復合形成sIgA，并分泌到母乳中[2]。母乳中的sIgA被認為是主要的免疫球蛋白，通過細胞內的中和、病毒排泄和免疫排斥以保護嬰兒免受病原體和毒素損害[3]。

母乳中sIgA的濃度可能受早產、感染、妊娠期糖尿病[4-7]等的影響，而這些因素大多與機體炎癥狀態有關。作為炎癥狀態的重要指標，中性粒細胞與淋巴細胞比例(neutrophil-lymphocyte ratio, NLR)已被廣泛用于妊娠期糖尿病、先兆子癇等的病因探討[8-9]。婦女孕早期的NLR水平也可能對母乳中的sIgA產生影響。本研究收集了產婦產后42 d左右的成熟乳，并對哺乳期的膳食情況進行調查，同時，收集孕早期血常規檢查信息和研究對象一般情況，探討孕早期炎癥狀態是否會影響成熟乳中的sIgA濃度。

對象與方法

一、對象

本研究以2018年6月至2019年6月在北京大學人民醫院生產的婦女為研究對象。納入標準：(1)在北京大學人民醫院接受產前檢查并生產的健康女性；(2)在產后42 d左右來臨床營養科進行營養咨詢,當日提供母乳且接受問卷調查。排除標準：(1)孕早期未接受任何檢測；(2)收集的母乳量不夠；(3)產后感染；(4)患有精神心理疾患和艾滋病、乙肝等傳染性疾病。

從募集的母乳庫中，本研究最終獲得具有成熟乳(≥5 ml)的所有研究對象,共計206例，其中204例接受了孕早期血常規檢測。

本研究已獲得北京大學人民醫院生物醫學倫理委員會批準。所有研究對象均經知情同意并簽署書面知情同意書。

二、方法

1.調查內容與方法：產婦知情同意后，從營養門診采集產婦一般情況，包括出生日期、民族、孕前身高、體重、既往史、孕產史、末次月經、分娩情況、體力活動情況等。

利用食物頻率調查問卷(FFQ)[10]調查產婦哺乳期的膳食習慣，對所有產婦進行從產后第一天到采集母乳當日的膳食攝入情況調查。參考中國食物成分表標準版(第六版)，計算調查對象每日營養素平均攝入量[11]。

2.生物標本采集：產婦來營養科就診當天，自行清潔乳房，手法擠乳為主，采集至少50 ml的母乳，將母乳儲存在儲奶袋里。若母乳是前一日的，則需由產婦自行將母乳冷凍后帶到醫院。

醫生及工作人員將收集好的母乳貼上標簽，準確記錄分娩日期、病案號和寶寶性別。采奶后入庫待用，冰箱內-80℃儲存。

3.實驗室檢測：使用血液分析儀(日本Sysmex公司，XN9000-B2(2))分析孕早期(小于12周)全血NLR，NLR=中性粒細胞絕對數/淋巴細胞絕對數。

采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Dogesce公司,DG11718H)檢測母乳中的sIgA。將母乳收集到無菌管中，2℃～8℃條件下離心20 min左右(2 000～3 000轉/分)。仔細收集上清備用，離心后如有渾濁形成，應再次離心。從室溫平衡 20 min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃；設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μl；樣本孔中加入待測樣本 50 μl，空白孔不加；除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μl，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60 min；棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液(350 μl)，靜置 1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板 5 次(也可用洗板機洗板)；每孔加入底物 A、B各50 μl，37℃避光孵育15 min；每孔加入終止液 50 μl，15 min內，在450 nm波長處測定各孔的OD值。

4.質量控制：所有調查人員均經專門的培訓，調查人員采用一對一面對面訪談的方式對產婦進行調查，由孕婦本人應答，問卷由調查人員填寫。為幫助被調查者更準確的估計食物攝入量，調查人員采用實物模型和食物標準圖譜供被調查者參考。問卷的錄入采用雙人雙錄入，若兩次結果有不一致之處，則會及時與原始問卷進行核對，對錯誤數據進行修正。

5. 統計學處理：分類變量將采用頻數(構成比，%)；連續變量根據數據情況采用平均值、標準差、中位數、四分位區間進行描述，對于服從正態分布的數據，使用均數±標準差來表示，對于不服從正態分布的數據，使用中位數及四分位數[P25，P75]表示；組間差異性檢驗時，連續變量采用t檢驗(正態分布和方差齊性)比較兩組間計量資料的差異；多組計量資料比較采用方差分析(正態分布和方差齊性)；采用多變量線性回歸法分析產婦孕早期NLR與成熟乳中的sIgA濃度之間的關系，納入方程的變量包括年齡、BMI、母乳天數、產次、早產、生產方式、平均每日蛋白質攝入量、平均每日能量攝入量和體力活動，以P≥0.1作為變量剔除標準。

妊娠期高血壓/糖尿病與炎癥和母乳中的sIgA相關，為探討二者關聯是否受疾病狀態的影響，以是否患有妊娠期高血壓/糖尿病進行分層分析。此外，考慮到由于可能的生理性和病理性因素，部分中性粒細胞和淋巴細胞絕對數出現較偏離的異常值，為避免這些異常值對結果產生影響，故進一步進行敏感性分析，去掉孕早期中性粒細胞和淋巴細胞絕對數的5%最高值，再次進行多變量線性回歸分析。

使用EpiData 3.1 建立數據庫。所有統計分析均采用Stata 14.0軟件實現。P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、人群特征分布情況

研究對象懷孕時的年齡不服從正態分布，使用中位數和四分位數間距[P25，P75]描述，中位年齡為30.9[28.9，34.0]歲，17.5%(36/206)的人孕前BMI偏高。此次收集的母乳中位天數為44.0[42.0，49.0] d成熟乳。除漢族外，還有6.4%(13/203)的人來自藏族、滿族、回族、瑤族和阿昌族。所有研究對象中，有19.9%(41/206)名產婦患有妊娠期高血壓或糖尿病。研究對象哺乳期平均每日蛋白質攝入量中位水平為107.4[82.8，124.1] g/d，高于中國營養學會推薦值(80 g/d)[12]；平均每日能量攝入量中位水平為1 960.3[1 602.2，2 325.5] kcal/d。見表1。

28.4%(58/204)的研究對象孕早期中性粒細胞絕對數偏高(大于6.3×109/L)，4.4%(9/204)淋巴細胞絕對數異常(小于1.1×109/L或大于3.2×109/L)。產婦孕早期的NLR中位水平為2.9[2.2, 3.5]，最小值1.3，最大值6.8；當不納入本研究中患有妊娠期糖尿病與高血壓的產婦后，剩余人群的中位NLR為2.8[2.2，3.5]。母乳中的sIgA平均濃度為(1 798.1±213.0)μg/ml。

表1 研究人群基本特征

二、孕早期NLR與母乳中的sIgA的多變量線性回歸

采用多變量線性回歸，變量篩選選擇逐步后退法。模型F=3.09，P=0.004， 包含NLR、年齡、體力活動、哺乳天數、產次、每日能量攝入量和每日蛋白質攝入量7個變量的模型具有統計學意義。當NLR增加1時，母乳中的sIgA濃度升高32.6 μg/ml；年齡每增加1歲，sIgA濃度降低7.1 μg/ml；隨著母乳天數的增加，sIgA濃度降低(β=-1.4)；經產婦與初產婦相比，其母乳中的sIgA含量增加。見表2。

三、分層分析

以是否患有妊娠期高血壓或糖尿病對孕早期NLR與母乳中的sIgA之間的關聯進行分層分析。患病人群與非患病人群的孕早期NLR中位數分別為3.0[2.2，3.6]和2.6[2.1，3.5]，差異無統計學意義。在患病人群中，NLR每增加1，母乳中的sIgA濃度升高72.6 μg/ml(P=0.04)；在非患病人群中，NLR每增加1，母乳中的sIgA濃度升高26.9 μg/ml，但不具有統計學意義(P=0.12)。見表3。

四、敏感性分析

剔除孕早期中性粒細胞和淋巴細胞絕對數的偏高值后，剩余169例，NLR中位數為2.8[2.2，3.5]。模型F=4.01，P<0.01， 包含NLR、年齡、體力活動、哺乳天數、產次和每日蛋白質攝入量6個變量的模型具有統計學意義。當NLR增加1時，母乳中的sIgA濃度升高45.4 μg/ml。見表4。

討 論

本研究對產婦成熟乳中的sIgA進行檢測，并探討了產婦孕早期的NLR水平對sIgA濃度的影響。結果顯示，在調整了年齡、BMI、母乳天數、產次、早產、生產方式、經能量調整的平均每日蛋白質攝入量后，孕早期妊娠期婦女的炎性水平與42 d成熟乳中的免疫成分sIgA濃度呈正相關, 當NLR增加1時，母乳中的sIgA濃度升高32.6 μg/ml。當剔除中性粒細胞和淋巴細胞5%的偏高值后，孕早期NLR水平與sIgA濃度關系的結論不變。

現有文獻中，尚無研究產婦孕早期的NLR水平與母乳sIgA濃度關系的報道。NLR的檢測方法簡單，計算方便，只需要通過全血細胞分析獲得淋巴細胞絕對數與中性粒細胞絕對數，經濟高效，是系統炎癥的重要指標，目前已被廣泛用于炎性疾病、腫瘤、心血管疾病等的預測[13-14]。而本研究第一次提出了孕早期NLR水平是成熟乳中sIgA濃度的影響因素。

表2 孕早期NLR與母乳中的sIgA多變量線性回歸

表3 孕早期NLR與母乳中的sIgA分層分析

表4 孕早期NLR與母乳中的sIgA敏感性分析

以是否患有妊娠期高血壓和糖尿病進行分層分析，結果顯示，疾病組孕早期NLR水平與母乳中的sIgA濃度關聯強度更高(β=72.6),說明患病人群更加敏感。已有研究表明，妊娠期高血壓和妊娠期糖尿病受母體炎癥狀態的影響[8, 15]，而對是否患有妊娠期糖尿病，兩組間的母乳sIgA濃度存在差異[6]，因此，炎癥、疾病與母乳免疫成分之間可能存在關聯，但具體的機制目前尚不清楚。有研究提示，對于妊娠期糖尿病人群，炎癥狀態可能通過誘發高血糖進而引起B淋巴細胞功能降低來影響sIgA[6]，但更多的大樣本人群研究和機制研究有待補充。

炎癥對于女性成功繁殖至關重要，從月經周期到懷孕初期以及分娩后期，生育過程的每個步驟都涉及炎癥過程，而孕早期處于促炎狀態，如IL-8、MCP-1/CCL-2升高[16]。本研究收集的孕早期血常規結果顯示，28.4%中性粒細胞絕對數偏高，4.4%淋巴細胞絕對數異常，但目前尚未有研究定論孕產婦的NLR正常參考值范圍。Viktoria等對希臘129名孕婦(流產VS正常生產)孕早期的NLR水平進行了統計，結果顯示正常生產組孕婦孕早期的NLR為(2.5±1.0)[17]；以色列地區孕早期正常人群為(2.60±1.01)[18]；比利時安特衛普大學醫院的138名對照組孕婦20周之前的NLR水平為(3.08±1.07)[19]。當剔除本研究中患有妊娠期合并癥的產婦后，剩余人群的中位NLR為2.8[2.2，3.5]，與多數研究相似，這也為中國女性孕早期的NLR水平提供了一個參考。

婦女孕早期炎癥狀態生理性增高，就母乳中的免疫球蛋白來說是有利的，sIgA濃度升高，將有助于保護嬰兒免受病原體和毒素損害。本研究中，母乳中的sIgA平均濃度為(1 798.1±213.0)μg/ml，但是不同地區的研究結果不同。重慶地區產婦產后3 d以后的成熟乳sIgA含量為(1 548.3±1 634.4)μg/ml(ELISA雙抗體夾心法)[20]。一項研究調查了河/湖地區、沿海地區和內陸地區產婦母乳中的免疫因子，結果顯示，產后28 d母乳中的sIgA中位濃度分別為438[370，667]、511[430，584]和488[384，736] μg/ml[21]。上海某醫院產后42 d門診收集的母乳，-80℃保存24周后，sIgA含量為6 743[3 076，13 239]μg/ml(ELASA法)[22]。對于國外的情況，一項研究收集了91位日本產婦的母乳，結果顯示，產后8周母乳中的sIgA濃度為1 084.7 μg/ml(酶免疫法)[23]。

本研究的優勢在于補充了孕早期炎癥水平與母乳中的免疫成分之間的關系，以往的sIgA相關因素探討多聚焦于人群特征和產后因素，鮮有關注孕期因素，因此今后的研究可更多的利用孕期信息來探討其對母乳成分的影響。此外，本研究還調整了膳食因素，進一步控制了混雜，使得二者之間的關聯更加準確。膳食調查采用FFQ,能夠以相對簡單、經濟高效且省時的方式評估長期飲食攝入量；估算營養素攝入量時，參考了最新的食物成分表；在考慮疾病的風險時，最基本的關注點是總能量攝入量調整后的營養素攝入量，而不是營養素的絕對攝入量，因此模型同時納入了總能量攝入量和體力活動。然而，由于缺少吸煙信息，模型中調整的因素不夠全面，不過中國女性吸煙并不普遍，對處于孕期和哺乳期的女性更是如此，因此帶來的偏倚可能較小。

綜上所述，本研究采用NLR作為母體孕早期的炎癥狀態標志物，發現孕早期NLR水平與成熟乳中的sIgA濃度呈正相關。今后可綜合考慮整個孕期的炎癥狀態，探討這一復雜的生理現象是如何對母乳中的成分產生影響的。