細胞如何適應外界變化的氧環境
——解讀2019年諾貝爾生理學或醫學獎*

陳子硯 王予涵 劉可可 王月丹**

（1 北京大學公共衛生學院 北京 100871 2 北京大學附屬中學實驗學校 北京 100032 3 北京大學基礎醫學院 北京 100191）

北京時間10月7日，2019年諾貝爾生理學或醫學獎在瑞典卡羅林斯卡大學醫學院揭曉。美國哈佛大學醫學院威廉·凱林（William G.Kaelin Jr.）教授、英國牛津大學彼得·拉特克利夫（Peter J.Ratcliffe） 教授和美國約翰霍普金斯大學醫學院格雷格·塞門扎（Gregg L.Semenza）教授共同獲得了這一殊榮［1］。

3 位科學家究竟憑借什么研究成果而獲得了這個醫學研究領域的頂級大獎？這就是對細胞在不同氧氣環境中代謝適應調節機制的研究和闡釋。細胞在不同氧氣環境中代謝適應機制的調節，與人們在生活中的垃圾分類還有幾分相似。

1 人類生活在氧氣含量不同的環境

人類生活在這個世界上，為了維持機體正常的生理活動，需要不停地消耗氧氣，進行能量與物質的代謝。人可1 周不吃飯，3 天不喝水，但時刻都離不開氧氣。測量結果表明，人體在正常空氣（氧氣比例為21%）中，每天需要吸入12 m3的空氣，消耗相當于500 L 的氧氣，當腦細胞缺氧超過6 min 時，即可因為能量代謝障礙而引起不可逆的死亡。當人體從氧氣分壓較高的低海拔地區前往高原地區時，有可能發生以頭痛、頭暈、心慌、氣短、氣急、惡心、嘔吐、乏力、失眠、眼花、嗜睡、手腳麻木、唇指紫紺和心率加快等癥狀為特征的“高原病”。多數高原病患者可在1 周內逐漸恢復，但少數患者可能會病情惡化，發生高原肺水腫和腦水腫，甚至有致命的風險。

然而，組織中的氧氣也會在代謝過程中，產生各種氧自由基等對細胞有損傷作用的物質，這些自由基可損傷細胞膜和線粒體等細胞器，導致細胞的損傷、衰老，甚至死亡。研究表明，動物吸入純氧后會出現氧中毒的表現，當人類進入一個大氣壓的純氧環境中，超過24 h 就會發生氧中毒型肺炎，最終可能會因呼吸衰竭而死亡。與高原病相反，人從氧分壓比較低的高原地區到達氧分壓較高的平原時，就會出現疲倦、無力、嗜睡、胸悶、頭暈和腹瀉等癥狀，人也覺得渾身懶洋洋的，就像喝醉了酒一樣，這被稱為“低原反應”，俗稱“醉氧癥”。

不僅如此，在人體內部，不同的組織器官之間也存在著氧氣含量的差異。例如，人體肺泡的氧分壓為104 mmHg，動脈血氧分壓為100 mmHg，組織中氧分壓為0 ～30 mmHg，靜脈血氧分壓為40 mmHg。而缺血時，組織的氧分壓可在原有基礎上進一步下降。

當發生冠心病和腦梗塞等血管阻塞性疾病時，組織內的含氧量會進一步下降，細胞可能會因缺氧而受損，甚至死亡。另一方面，當阻塞的血管復通后，缺氧組織內的氧氣含量急劇增加，又可能造成組織內大量自由基產生，以及鈣超載和線粒體損傷等細胞損傷，也可導致組織細胞的死亡。這種現象被稱為缺血再灌注損傷。

2 機體和組織細胞對低氧環境的適應及其機制

由于不斷面臨不同含氧的環境，動物機體和組織細胞必須不斷對自身的生理代謝過程進行調節，適應不斷變化的氧氣環境。例如，人類到了高原后，血液中的紅細胞數量和血紅蛋白含量會大量增加，提高血液攜帶氧氣的能力，從而在氧氣分壓較低的環境中，保證人體細胞代謝所需要的氧氣供應。

而當血管發生血栓等阻塞性疾病時，缺血組織細胞會調節自身的代謝，降低耗氧量，以適應低氧的環境，而這些組織細胞周圍的血管也會不斷增生，進入缺血組織，甚至形成側枝循環，逐漸替代阻塞的血管，滿足缺血組織的氧氣需要。而在阻塞血管復通之后，組織細胞又會產生大量對抗和清除自由基的物質，并調整細胞代謝以適應高氧的環境。

長期以來，人們一直十分關注機體和組織細胞適應不同含氧環境機制的研究。1957年，Reissman 等采用聯體畸形的動物進行缺氧實驗研究，發現其中一只動物處于缺氧環境中呼吸而另一只動物處于正常大氣中呼吸時，二者體內都會出現同樣的骨髓紅細胞增生現象。后來，人們在此基礎上分離發現了缺氧可促進腎臟產生促紅細胞生成素（EPO），拉開了對組織細胞氧環境適應機制研究的大幕。

1992年，美國約翰霍普金斯大學醫學院塞門扎教授帶領的課題組發現了缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）及其生理功能［2］。這些發現，極大推動了對細胞如何感受氧氣濃度并改變生理代謝功能及其機制的研究。他們的研究結果表明，氧氣跟細胞能量代謝密切相關，但氧氣對于細胞的作用不只限于提供能量代謝，在生物進化過程中形成的很多生理功能其實都是受到氧氣的作用進行調控的［3］。在塞門扎教授1995年發表在PNAS 雜志上的一篇重要相關文獻中，排名第一的作者是來自中國的王廣良先生。在獲悉塞門扎因為發現HIF 而獲得2019年諾貝爾生理學暨醫學獎后，王廣良回顧了當時發現該分子的艱苦經歷。據他介紹，當時塞門扎的實驗室正在利用給細胞培養箱中輸入低濃度氧氣的方法模擬低氧環境，通過培養人子宮癌細胞株Hela 細胞，尋找該細胞中能感受氧氣濃度下降而調控EPO 基因轉錄增強的機制。在耗時1年多的研究工作中，他們使用能與活性蛋白結合的EPO 基因增強子序列制成的親和柱，從幾百升細胞懸液中最終得到了幾毫克的HIF 蛋白。進一步通過蛋白酶切和測序，根據獲得的氨基酸殘基序列，塞門扎等推測出HIF的DNA 序列，并制成相應的DNA 序列探針，從人類基因序列庫中成功調取到了HIF 基因的序列（圖1）。從現代生物技術的角度看，這個工作絕對是一個經典的分子克隆故事。

圖1 塞門扎實驗室實驗流程模式圖

在隨后對于HIF 的結構與功能研究中，人們發現HIF 家族包括HIF-1、HIF-2 和HIF－3 等多個成員。其中，HIF-1 和HIF-2 具有一定的同源性，均是由α 和β 2 個亞基組成的異源二聚體［9］。其中，HIF-1α 和HIF-2α 是主要的氧調節原件，它們具有的結構均包括螺旋-套-螺旋（bHLH）區、PAS 結構域、氧依賴性降解區（ODD）和激活區（TAD）等結構域。在缺氧環境中，HIF-1α 從細胞質中被轉運到細胞核中，通過bHLH 和PAS 結構域與組成性表達的β 亞基（也稱為芳香烴受體核轉運蛋白，ARNT）相結合，從而調控下游基因的轉錄與表達，發揮轉錄活性，可分別參與調節紅細胞增殖、新生血管形成、能量代謝和細胞周期與凋亡等重要生理過程（圖2）。

圖2 HIF-1α 分子結構模式圖

HIF 主要通過促進EPO 及其受體的表達和分泌，使骨髓中紅細胞的生成增加，提高血液攜帶氧氣的能力，緩解組織細胞的缺氧狀態。HIF 可促進血管內皮生長因子（VEGF）、纖維母細胞生長因子（FGF）和轉化生長因子β（TGF-β）等與血管和淋巴管生長相關的細胞因子，促進缺氧組織中的血管生成，恢復組織的正常供氧狀態。HIF 還可誘導腺苷酸激酶3、烯醇化酶1、1，3，3-磷酸甘油醛脫氫酶、己糖激酶1 和2 等能量代謝相關分子的表達，從而促進糖酵解的過程，彌補在低氧狀態下由于呼吸鏈不能正常運行而減少的ATP，維持細胞在缺氧狀態下的生理活動。此外，HIF 還能通過調節P21 和P27等細胞周期依賴激酶抑制分子等的表達及Bcl-2和p53 等凋亡相關分子的表達，參與細胞周期和凋亡的調控。一般認為，在缺氧狀態下細胞阻滯在G1期和細胞凋亡的發生，都與HIF 的功能有關。

3 機體和組織細胞在正常氧濃度環境中對于HIF 的調節及其機制

HIF 及其功能的發現，揭示了細胞在低氧和缺氧環境中，通過調節能量代謝和改善氧氣供應，進行適應的機制。但是，在正常氧濃度的環境中，細胞又是如何進行能量代謝的調節和適應環境氧氣濃度的？彼得·拉特克利夫威廉·凱林的研究工作對這個過程和機制進行了揭示。

有趣的是，人們了解細胞對正常氧氣濃度環境的適應機制，首先是從對一種遺傳性疾病的研究開始的。1895年，德國眼科醫生馮·希佩爾（Von Hippel）發現視網膜血管母細胞瘤具有家族性遺傳特征；1926年，瑞典眼科醫生林島（Lindau）進一步觀察到，視網膜和小腦血管母細胞瘤不僅是中樞神經系統血管瘤病灶的一部分，而且具有遺傳性；1964年，Melmon 和Rosen 在對多篇類似臨床病例報告進行總結的基礎上，將中樞神經血管母細胞瘤合并腎臟或胰腺囊腫、嗜鉻細胞瘤、腎癌及外皮囊腺瘤等疾病，統一命名為“馮·希佩爾-林島綜合征（Von Hippel-Lindau syndrome）”，簡稱VHL 綜合征。研究表明，VHL 綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，其主要原因是定位于人類第3 號染色體短臂的VHL 基因發生突變所引起的細胞內分子代謝紊亂。可是，VHL 基因突變導致神經血管瘤發病增加的具體機制，一直都在不斷探索之中。

研究發現，在正常氧氣條件下，在組織細胞中幾乎不含有HIF-1α。但是，當氧氣水平大幅下降之后，細胞中的HIF-1α 含量會大量增加，并且進入細胞核，上調EPO 和其他HIF 相關基因的表達，使組織細胞適應低氧環境，減少組織細胞因缺氧而遭受的損傷甚至死亡。其中，威廉·凱林在對VHL 綜合征的研究中發現，VHL 基因編碼的VHL蛋白是一種抑癌因子，當VHL 基因發生突變后，就會產生功能異常的VHL 蛋白，并使細胞內很多受到HIF 調控的缺氧調節分子（例如，血小板衍生生長因子、VEGF、TGF-α 及EPO 等）大量產生，導致細胞的能量代謝、血管生長、細胞周期、細胞凋亡及炎癥反應等許多生理過程發生改變，從而使細胞癌變的風險增加。但是，當凱林將正常的功能性VHL 基因轉入VHL 基因突變的腫瘤細胞中時，細胞內的HIF-1α 含量則恢復正常。后續的研究表明，VHL 本質上是一種泛素連接酶，可將靶蛋白分子泛素化，而被泛素化的蛋白質，就會被轉運到細胞蛋白酶體中進行降解［4］。因此，VHL 通過給HIF-1α 打上泛素化的標簽，從而調控后者在細胞中的降解和代謝，抑制細胞發生癌變。

為了揭示氧氣對于VHL 調節HIF-1α 的確切機制，凱林和拉特克利夫帶領的課題小組分別進行了進一步的深入研究工作。他們發現在HIF-1α的分子結構中存在著一個富含脯氨酸的氧依賴性降解區（ODD）。當氧氣濃度較高時，這個部位的脯氨酸中氫原子經常會與氧氣發生反應，發生脯氨酸羥基化，從而具備了被VHL 識別并結合的能力，繼而可被泛素化并降解。拉特克利夫還發現了可催化這個過程的關鍵酶——脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylases，PHD）［5］。HIF-1α 在PHD 的作用下發生脯氨酸羥基化修飾，是VHL 識別并將其泛素化降解的基本條件，但是在缺氧調節下，PHD 的活性急劇下降，甚至失活，導致HIF-1α 的羥基化過程受到抑制，無法被VHL 識別和降解，從而啟動受到該分子調控的缺氧相關因子的表達，使細胞發生適應低氧狀態的能量代謝變化［6］。

圖3 低氧環境與高氧環境下VHL 對HIF-1α 調節機制模式圖

4 利用機體和組織細胞氧適應調節的機制治療疾病

經過塞門扎、凱林和拉特克利夫等人的不斷努力，組織細胞適應環境氧氣濃度變化的機制終于被闡明。這對于人們利用該機制治療相關的疾病，具有非常重要的價值。

首先，VHL 蛋白抑癌作用主要是通過調控HIF 的泛素化降解實現的，而HIF-1α 可調控人體約5%的基因表達，這些基因與缺氧下的組織細胞能量代謝改變或缺氧適應有關，其中大多數基因也與腫瘤的發生與發展有關［7］。因此，VHL／HIF-α 通路及其下游調控基因是研發腫瘤治療藥物的重要靶點。目前，人們已經開始借助靶向藥物，例如VEGF 的中和性單克隆抗體（貝伐珠單抗）、針對VEGF 和PDGF 受體的小分子抑制劑（例如舒尼替尼、索拉非尼和阿西替尼等）及可抑制HIF 轉錄的mTOR 酶抑制劑等，阻斷HIF 的致癌作用，用于VHL 綜合癥和腎癌等其他惡性腫瘤的 治 療［8］。

同時，組織缺氧缺血性疾病也是利用VHL／HIF通路進行治療的相關疾病。例如，冠心病和腦梗塞的患者，在發生供血不足時，需要通過周圍血管的代償性增生，最終形成側枝循環，從而替代阻塞的血管，恢復組織細胞的正常供氧。在此過程中，可使用VHL 抑制劑（例如VH-298），減少HIF 的降解，增加VEGF 等促進新生血管形成的細胞因子產生，從而加速緩解組織缺氧的狀態，減少心肌或腦細胞的損傷，這對于緩解病情和促進疾病的康復，都具有非常重要的臨床價值。

此外，由于VHL/HIF 是調控EPO 生成的重要調節通路，利用該通路治療紅細胞減少等貧血癥狀，也是非常合理的臨床治療手段。2019年7月，美國著名的醫學期刊The New England Journal of Medicine同時在線發表2篇應用小分子低氧誘導因子脯氨酰羥化酶抑制劑羅沙司，治療慢性腎病透析患者頑固性貧血的III 期臨床試驗研究及其結果，證實該藥在治療頑固性貧血中具有良好的療效。目前，羅沙司他作為一種作用機制創新的貧血治療藥物，已分別在中國和日本獲得批準上市。

由此可見，對于VHL／HIF 在細胞氧環境適應調節中的作用及其機制研究，不僅推動了組織細胞能量代謝調節作用的基礎研究，而且對于治療惡性腫瘤、心腦血管疾病和頑固性腎性貧血等重大人類疾病，都具有十分重要的臨床價值，有利于改善這些患者的治療效果及其預后。因此，凱林、拉特克利夫和塞門扎等3 人作為揭示組織細胞氧環境適應分子機制的發現者，獲得2019年諾貝爾生理學暨醫學獎，是當之無愧的。