微生物菌種保存方法及技術要點

摘要：微生物保存是依據菌種變異快的特點，通過一定方法降低微生物的代謝活性，從而延長其保存期限。本文對微生物菌種保存方法進行概述，并分別闡述藥品微生物菌種的主要保存方法和工業(yè)微生物菌種主要保存方法。只要選擇恰當?shù)谋４娣椒ǎ胚_到良好的保存效果，真正實現(xiàn)保存的目的。

關鍵詞：微生物菌種;保存方法;技術要點

現(xiàn)階段，微生物產業(yè)已具相當大的規(guī)模，其中在發(fā)達國家占有生產總值比重較高。在微生物產值的不斷增長的前提下，其中在工業(yè)、醫(yī)藥、農業(yè)等多個領域發(fā)揮著重要作用。本文主要對工業(yè)微生物菌株和藥品微生物菌株的保存方法進行分析研究，可以得出其保存方法是否合理對保持菌株的優(yōu)良特性十分重要。

1、微生物菌種保存方法概述

微生物菌種是一個基本的分類單元，其表型特征極其相似，并且與同屬其他菌種有差異很大[1]。環(huán)境條件對微生物菌種的繁殖過程有一定的影響，其保存的主要目的是保持菌種的原有活力和形狀，更好的完成微生物檢驗等工作。基于此，要做好優(yōu)良的菌種的選擇工作，將其代謝水平降低到最低，保證菌種不發(fā)生變異并保持相應的活性。菌種保存方法還要考慮到保存方法的經濟性與便捷性，主要是操作成本以及生產推廣使用的可行性。

2、藥品微生物菌保存方法闡述

2.1? 斜面低溫保藏法

此方法是一種經常使用的保藏法，主要是將微生物菌種轉移培養(yǎng)到斜面培養(yǎng)基中，待到微生物菌種全部覆蓋于整個斜面之后，將其低溫保藏，溫度一般為4℃。通過一段時間之后，對微生物菌種按照相同的方法進行轉培，通過保藏方法以及不斷轉培進行菌種的保藏。該方法具有的優(yōu)勢主要體現(xiàn)在操作簡單、對操作設備要求低，并且菌種的存活率比較高。此方法適用于多種微生物菌種的短期保藏，其保存菌種的時間為幾個月，并不適合需要長期保藏的菌種。在溫度為4℃的情況下，菌種一般還具有一定的代謝水平，會使菌種的活性降低。同時，反復多次的培養(yǎng)菌種，容易使菌種發(fā)生變異，引發(fā)感染現(xiàn)象等。

2.2? 石蠟油封藏法

此方法主要適用于培養(yǎng)成熟微生物菌種斜面，采用做過無菌處理并去除水分的石蠟，將培養(yǎng)斜面進行封存[2]。保證石蠟層的厚度比培養(yǎng)斜面頂端高大約1厘米，確保所培養(yǎng)的微生物菌種無法接觸到空氣。在封存完畢之后，使用固體石蠟將其封口，并垂直放于冰箱中，并保證冰箱的溫度為4℃。此方法即考慮到低溫，又考慮到與氧氣隔絕，有效降低培養(yǎng)菌種的活性，使其延長保存菌種的時間，適合于保存1-2年的菌種。

2.3? 定期移植法

此方法是通過不斷傳代培養(yǎng)進行保藏，主要保存方法有斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)等，根據需要培養(yǎng)微生物菌種生存特性而選擇不同的培養(yǎng)方法，此方法十分普遍。將微生物菌種接種于適宜的環(huán)境中進行培養(yǎng)，避免由于環(huán)境改變誘發(fā)菌種遺傳物質的改變，使其改形狀，等到成長充分之后選擇4-6℃的環(huán)境中進行間隔保存，再進行傳代培養(yǎng)，其保藏時間要根據微生物菌的不同而不同。此保藏方法具有操作簡單、易于提取的優(yōu)勢，但需要經常移種培養(yǎng)，并且在培養(yǎng)的過程中微生物菌種無法完全與外部環(huán)境隔絕，而如果要長期保藏，該方法需要人力成本比較高，所以如果僅用于實驗需要，短期內的保藏可以使用定期移植法。

3、工業(yè)微生物菌種保存方法

3.1? 斜面低溫保存法

斜面低溫保存法經常用于工業(yè)微生物菌種實驗室保存，主要適合不需要長期保存的菌株。為控制和防止菌種出現(xiàn)污染的現(xiàn)象，應該連續(xù)保存三代培養(yǎng)斜面。其優(yōu)點主要體現(xiàn)在操作簡單，菌株使用十分便捷，對設備無特殊要求。此方法的缺點是存儲時間短菌種容易發(fā)生變異，在存儲的過程中容易被感染。此方法的保存質量受到溫度的影響。若培養(yǎng)時間比較短，在保存的過程中容易死亡;若培養(yǎng)的時間比較長，生產效率高。

3.2? 干燥保存法

微生物的芽孢在干燥的環(huán)境中具有很強的抵抗力，干燥的環(huán)境可使微生物菌種的代謝活性降低到休眠的狀態(tài)。干燥保存法主要是將菌種接種到合適的材料中，人為創(chuàng)造適宜的干燥環(huán)境，進行菌株的保存，其干燥環(huán)境可以借助于沙子、濾紙等。比如濾紙保存法，是將細胞或者是孢子吸附在無菌的濾紙上，進行干燥處理之后在低溫保存，溫度可設置為4℃，細菌可保存2年左右，對于一些絲狀真菌甚至可以高達14-7年的保存期限。該方法具有保存時間長以及維護簡單等優(yōu)勢。

3.3? 超低溫保存方法

該方法主要是將微生物菌種保存在零下150-零下195℃的超低溫環(huán)境中，通常使用的甘油為菌株保護劑[3]。一般微生物的代謝在-130℃以下狀態(tài)，會出現(xiàn)完全停滯狀態(tài)，因此超低溫保存法被認為最有效的防止細菌降解的方法。在制冷技術不斷發(fā)展的基礎上，超低溫保存法已有幾十年的使用歷史，主要應用于工業(yè)領域菌種。此方法對各種微生物菌種都可使用，主要通過使用保護劑的細菌懸液密封于無菌冷凍管中，再進行緩慢冷凍。最佳冷卻的速度為1℃/min。當溫度降到零下35℃時，微生物懸液會迅速被放到液氮罐中。當在進行細菌的培養(yǎng)時，需要將其迅速融化，然后在合適的溫度下在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

4、結束語

微生物資源是我國主要的戰(zhàn)略生物資源，對微生物菌種的合理保存是十分重要的，對于微生物菌種保存方法既要考慮到經濟性與便捷性，還要考慮到操作成本以及生產推廣使用的可行性。對于藥品微生物的保存方法，其中斜面低溫保藏法是最為常見的保藏法，另外石蠟油封藏法、定期移植法等也經常應用于藥品微生物的保存。而工業(yè)微生物菌種保存方法主要有邊坡低溫保存法、干燥保存法以及超低溫保存方法等。根據需要保存菌種的不同，選擇合適的保存方法，才能達到最佳的效果。在選擇合適保藏方法的基礎上，做好日常管理工作，才能夠真正將微生物檢驗的作用發(fā)揮出來，為科學研究提供參考。

參考文獻：

[1]?? 黃家樂，王玥，何睿，裘暢，徐雪娥.制藥企業(yè)微生物實驗室菌種保存方法的探討[J].中國藥事，2017，31（09）：1007-1011.

[2]?? 韓映晨，崔鉉，安賢蘭，高杰.淺談藥品微生物檢驗用菌種保藏方法[J].中國衛(wèi)生標準管理，2017，8（20）：104-106.

[3]?? 費嫦，桂芳，李爭鳴，王林.醫(yī)學微生物實驗室四種菌種保存方法的比較[J].醫(yī)學理論與實踐，2017，30（12）：1827-1829.

[4]?? 張競帆.Bacillus mojavensis B1811與Burkholderia pyrrocinia B1213降解鄰苯二甲酸酯的特性與途徑研究[D].2018.

[5]?? 戴宇婷，劉自昭.藥品檢驗常用標準菌種的斜面保藏方法研究[J].中國衛(wèi)生標準管理，2019，010（005）：69-71.

[6]?? 徐玲玲，張丹丹，張焱.兩種微生物菌肥細菌菌種分離、鑒定及活性研究[J].遼寧農業(yè)科學，2019，000（001）：22-25.

[7]?? 趙嘉寧.農業(yè)微生物資源在國家經濟及生態(tài)環(huán)境建設中的重要作用[J].江西農業(yè)，2018，No.137（12）：93.

作者簡介：

趙青（1988年5月），性別：女，籍貫：陜西寶雞，職稱：助理工程師，學歷：本科，研究方向：微生物發(fā)酵技術.