3 株W135 群腦膜炎奈瑟菌多位點序列分子分型分析

李曲文，黃夢穎，謝方欽，林震宇，徐海濱，翁順太

（福建省疾病預防控制中心；福建省人獸共患病研究重點實驗室；福建醫科大學公共衛生學院專業教學實習基地，福建 福州350000）

隨著A+C 群流腦疫苗的普及， 流腦的發病率呈逐年下降趨勢，但流腦病例菌群呈一定程度多樣性變遷。 由于菌株在疫苗的選擇性壓力情況下，可使人群中存在腦膜炎奈瑟菌血清群和毒力發生一定的遺傳變遷，一旦發生血清群的轉換，則又有可能引起新的流腦大流行[1]。 多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST） 通過測定多個管家基因的核苷酸序列，反應細菌基因水平的遺傳學衍變[2]。 通過ST 分型可分析菌株進化關系以及在判斷分離株是否屬高致病性克隆系等方面，可彌補傳統方法分型的不足。本中通過MLST 分析我省分離的 3 例W135 菌株的 ST 型別， 以期為我省 W135流腦防控做一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 福建省2006-2019 年我科實驗室分離的W135 群流腦病例菌株3 株。 生化鑒定情況: 梅里埃API NH 鑒定編碼為 5002， 鑒定率為99.9% Neisseria meningitidis; 梅里埃VITEK 2 NH卡鑒定編碼均為3634400000，鑒定率為98% Neisseria meningitidis。血清凝集實驗為：3 株均與W135群凝集，而與其他血清群不凝集；常規PCR 檢測結果均為：CrgA 基因陽性，Orf-2(A)基因陰性，SiaD(B)基因陰性，SiaD(C)基因陰性，SiaD(W135)基因陽性。

1.2 主要儀器和試劑 Taq DNA 聚合酶、dNTP 購自大連寶生物工程有限公司，瓊脂糖為BioAsia 分裝品。 Gel Doc XR+凝膠成像系統，Basic 電泳儀，PCR 擴增儀為ABI 公司。 引物序列由福州鉑尚有限公司合成，見表1、表2。

1.3 方法

1.3.1 樣本DNA 制備 腦膜炎奈瑟菌接種到血平板，37°C，5% CO2，24h 培養；刮取純的菌苔用于提取基因組DNA。

表1 PCR 擴增引物

表2 PCR 測序引物

1.3.2 PCR 反應條件 50.0μl 體系(純水 25.7μl，10x PCR 緩沖液 5.0μl，上游引物 5.0μl10μM 儲存濃度，1μM 終濃度，下游引物 5.0μl10μM 儲存濃度，1μM終濃度，dNTP 混合液 8.0μl，Taq 聚合酶 0.3μl 1.5個單位，DNA 模板 1μl 50ng 左右）PCR 擴增條件：95°C，2min，（95°C，1min；Tm，1min；72°C，2min） ×30 cycels，72°C，5min(備注 Tm 根據不同因素設置）。

1.3.3 PCR 產物的檢測及產物測序 PCR 產物編號送福州鉑尚公司測序（雙向）。

1.3.4 序列比對分析 樣本序列與MLST 網站數據庫中已有序列進行比對。獲得ST 型。7 個位點均獲得序列號后，可以獲取菌株的ST 型別號和序列群編號。 然后經BN 軟件聚類分析。

2 結果

2.1 7 個管家基因擴增的電泳圖

圖1 Nm7 個管家基因擴增結果

2.1 MLST 結果 通過對流腦的7 個管家基因進行擴增后進行DNA 測序，序列經 PubMLST 比對后，得出3 株W135 群腦膜炎奈瑟菌有兩株為ST11型，一株屬于ST4821 型。

圖2 MLST 結果

3 討論

腦膜炎奈瑟菌根據莢膜多糖的結構特征分為A、B、C、H、I、K、L、W135、X、Y、Z、29E 等 12 個血清群，其中，A、B、C、W135、Y、X 群是目前主要流行的致病菌群。 腦膜炎奈瑟菌具有高度的遺傳多樣性和高頻基因重組的特征，且易出現自發突變和與外源性基因的整合重組，因而克隆群具有呈現多樣性特征。 MLST 是一種通過分析一般測定 6～10 個管家基因，內部400～600 bp 核心片段的核酸序列測定的細菌分型方法，根據發現時間的順序賦予每個位點的核苷酸序列一個等位基因編號，組成等位基因譜即序列型(sequencetype，ST)。 1998 年由 Maiden等首次運用于腦膜炎奈瑟菌的分型，MLST 可分析菌株的譜系關系，對發現常規的表型方法不能分型以及新出現的變異，具有明顯優勢。 同時MLST 分型可用于國際實驗室間比對、溯源以及分子流行病學、遺傳進化等，從而準確地研究菌株遺傳進化關系，以確定種屬[3]。

自2006 年福建省報道了我國首例W135 群之后在廣東、廣西、江蘇、安徽等省(自治區)也相繼出現了W135 型腦膜炎奈瑟菌病例[4-6]。 我省在2019年又出現了W135 流腦病例，為了探討分析菌株之間的遺傳相關性，我們對3 株W135 菌株進行MLS T 分型，其中兩株為 ST-11，一株為 ST-4821。 目前，全球流腦病例主要由7 個高致病性Nm 序列群的菌株引起， 分別是 ST1 序列群、ST5 序列群、ST8序列群、ST11 序列群、ST32 序列群、ST4144 序列群以及 ST4821 序列群[7，8]。 2005 年以前，中國 W135群 Nm 均屬于 ST174；2006 年，ST11 和 ST4821 出現；2008 年，ST174 消失，ST11 成為優勢克隆群；與ST4821 相比，ST11 與病人關系更緊密。 ST11 全球主要的高致病克隆系之一，該型曾在非洲引起大規模的暴發[9]，我省 2 例 W135 也屬于 ST11，提示我省病例菌株也屬于高致病性克隆系。 同時我省W135菌株也有一株屬于ST4821，ST-4821 在我國曾于2003 年出現 ST-4821 型的 C 群流行，2015 年也出現了ST4821 的B 群的流行，朱兵清等學者發現ST 4821 的B 群與C 群具有相同的遺傳背景，可能是由于存在莢膜轉換[10-14]。 我省分離到的ST4821 的W135 群是我省首次分離到的ST 型別，也提示了我省存在W135 的遺傳多態性。

隨著流腦疫苗的接種，菌群不斷出現變遷，了解菌株之間的變異遺傳進化關系，對于防控流腦的爆發具有重要的指導意義[15，16]。 MLST 方法能為判斷流腦流行趨勢提供一定的分子流行病學依據。我省存在W135 群遺傳分子分型多態性，應引起我省的重視以防范W135 流腦暴發和流行的風險。