超分辨率圖像重構與CI 反卷積共聚焦成像技術對蒿草樣本熒光成像的分析研究

吳偉全，李元歌，唐金鳳，王思捷，楊騰，吳平

（廣東醫科大學附屬醫院，廣東 湛江 524001）

普通熒光顯微鏡和普通共聚焦顯微鏡系統能采集生物組織樣本的熒光圖像[1-4]，但它們都沒有超分辨成像功能，不可以獲取超分辨率熒光圖像。隨著顯微鏡系統的不斷發展，出現新型的超分辨率共聚焦系統，具有超分辨率圖像重構(Super-Resolution Image Reconstruction，SR)與 CI 反卷積（Constrained Iterative Deconvolution）成像新技術，但由于超分辨率圖像重構及CI 反卷積成像技術處于起步階段，類似研究罕見，因此需進一步探索其使用價值。 本實驗擬用超分辨率圖像重構共聚焦成像技術對蒿草樣本的熒光圖像進行采集，并使用其軟件cellSens 的CI 反卷積功能處理圖像，分析超分辨率圖像重構與CI 反卷積共聚焦成像技術檢測生物組織樣本超分辨率熒光圖像的使用價值。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和相關樣本 DMI3000B 熒光倒置顯微鏡（德國萊卡公司）；TCS SP5 II 共聚焦顯微鏡系統（德國萊卡公司）；新型FV3000 共聚焦顯微鏡系統（日本奧林巴斯公司），配有OSR 超分辨圖像重構及CI 反卷積模塊。蒿草樣本（德國萊卡公司），為DAPI、FITC 及TRITC 熒光染色后固定在載玻片上。

1.2 實驗分組 根據不同顯微鏡類型及成像技術分為四組:1 組:熒光倒置顯微鏡采集蒿草樣本熒光圖像；2 組: 普通共聚焦系統采集蒿草樣本熒光圖像；3 組: 新型共聚焦系統超分辨率圖像重構技術采集蒿草樣本超分辨率熒光圖像；4 組: 新型共聚焦系統CI 反卷積功能處理蒿草樣本超分辨率熒光圖像。 每組重復3 次。

1.2 熒光倒置顯微鏡采集蒿草樣本熒光圖像 使用德國Leica DMI3000B 熒光倒置顯微鏡， 分別用紫外光、 藍光和綠光為激發光激發DAPI、FITC 及TRITC 三染色的蒿草樣本，物鏡為40 倍鏡，采集熒光圖像。

1.3 普通共聚焦系統采集蒿草樣本共聚焦熒光圖像 使用德國Leica TCS SP5 II 共聚焦顯微鏡系統，分別用 405nm、488nm 和 543nm 波長激發 DAPI、FITC 及 TRITC 三染色的蒿草樣本， 物鏡為 40 倍鏡，采集共聚焦熒光圖像。

1.4 新型共聚焦系統超分辨率圖像重構成像采集蒿草樣本的超分辨率熒光圖像 使用新型日本奧林巴斯 FV3000 共聚焦顯微鏡系統， 分別用405nm、488nm 和 561nm 波長激發 DAPI、FITC 及TRITC 三染色的蒿草樣本，物鏡為60 倍油鏡，采集超分辨熒光圖像。

1.5 新型共聚焦系統CI 反卷積功能處理蒿草樣本的超分辨率熒光圖像 新型日本奧林巴斯FV3000共聚焦系統采集超分辨率熒光圖像后， 啟動軟件cellSens 的CI 反卷積功能，處理蒿草樣本超分辨率熒光圖像，獲得相關樣本的超分辨率反卷積圖像。

1.6 統計學處理 各組熒光圖像熒光強度值由軟件LAS X3.0 采集，數據資料經SPSS 17.0 統計軟件統計分析，數值用±s 表示。數據分析用方差分析，多樣本均數比較選用 LSD 法、Dunnett 法。 P＜0.05被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 熒光倒置顯微鏡采集的蒿草樣本熒光圖像蒿草樣本經DMI3000B 熒光倒置顯微鏡采圖，DAPI染色為藍色的熒光圖像；FITC 染色為綠色的熒光圖像；TRITC 染色為紅色的熒光圖像; 另外可得三色疊加的熒光圖像（見圖1A、1B、1C 和 1D）。 DAPI染色熒光圖像熒光值為31.40±0.09；FITC 染色熒光圖像熒光值為15.47±0.25；TRITC 染色熒光圖像熒光值為 40.93±0.02。 見表1。

圖1 DMI3000B 熒光倒置顯微鏡采集的蒿草樣本熒光圖像(400×)

2.2 普通共聚焦系統采集的蒿草樣本共聚焦熒光圖像 蒿草樣本經TCS SP5 II 共聚焦顯微鏡系統采圖，DAPI 染色為藍色的共聚焦熒光圖像；FITC染色為綠色的共聚焦熒光圖像；TRITC 染色為紅色的共聚焦熒光圖像;另外可得三色疊加的共聚焦熒光圖像；與熒光倒置顯微鏡組（1 組）的比較，相同倍數共聚焦熒光圖像圖像清晰度高，可以清晰顯示蒿草樣本切片的整體切面結構（見圖2A、2B、2C 和2D）。 DAPI 染色熒光圖像熒光值為 39.49±1.23；FITC 染色熒光圖像熒光值為 20.65±0.13；TRITC染色熒光圖像熒光值為47.58±0.15；相同倍數不同染料染色熒光圖像熒光強度分別與熒光倒置顯微鏡組（1 組）的比較，熒光圖像更亮，熒光值增高，有統計學意義（P＜0.05）。 見表1。

2.3 新型共聚焦系統超分辨率圖像重構采集的蒿草樣本超分辨率熒光圖像 蒿草樣本經FV3000 共聚焦顯微鏡系統超分辨率圖像重構采圖，DAPI 染色為藍色的超分辨率熒光圖像；FITC 染色為綠色的超分辨率熒光圖像；TRITC 染色為紅色的超分辨率熒光圖像;另外可得三色疊加的超分辨率熒光圖像；與普通共聚焦系統組（2 組）的比較，可以獲取高倍數的蒿草樣本超分辨率熒光圖像 （見圖3A、3B、3C 和 3D）。DAPI 染色熒光圖像熒光值為 7.11±0.02；FITC 染色熒光圖像熒光值為 14.11±0.09；TRITC 染色熒光圖像熒光值為 13.12±0.10。 見表1。

圖2 TCS SP5 II 共聚焦顯微鏡系統采集的蒿草樣本共聚焦熒光圖像（400×）

2.4 新型共聚焦系統CI 反卷積功能處理的蒿草樣本超分辨率反卷積圖像 新型FV3000 共聚焦系統采集超分辨率熒光圖像后，再使用軟件cellSens 的CI 反卷積功能處理，分別獲得其超分辨率反卷積圖像（見圖4A、4B、4C 和 4D）。 與新型共聚焦系統超分辨率圖像重構技術組（3 組）的比較，可更清晰觀察到蒿草樣本切片的細微結構（見圖4D 中箭頭指示部分）。 DAPI 染色熒光圖像熒光值為17.35±0.23；FITC 染色熒光圖像熒光值為 15.86±0.07；TRITC 染色熒光圖像熒光值為16.09±0.24；相同倍數不同染料染色超分辨率反卷積圖像熒光強度分別與新型共聚焦系統超分辨率圖像重構技術組（3組）的比較，圖像更亮，熒光值增高，有統計學意義（P＜0.05）。 見表1。

圖3 新型FV3000 共聚焦系統超分辨率圖像重構采集的蒿草樣本超分辨率熒光圖像（3000×）

3 討論

熒光（fluorescence）是指利用一定波長的光致發光的發光現象[5]。 熒光顯微鏡是生物組織樣本熒光成像的重要儀器，可以采集生物組織樣本熒光圖像，但由于是普通光源，獲取熒光圖像效果一般，有一定局限性[6，7]。本實驗的熒光圖像結果也體現了這個局限性。

共聚焦顯微鏡系統是使用激光光源結合共聚焦技術一種顯微鏡，得到的共聚焦熒光圖像克服了熒光顯微鏡熒光圖像效果不佳的缺點，因而其熒光圖像效果較好[8-10]。 與熒光倒置顯微鏡的熒光圖像比較，本實驗結果也顯示相同倍數共聚焦熒光圖像圖像清晰度更高，可以清晰顯示蒿草樣本切片的整體切面結構，熒光圖像更亮，熒光值增高，有統計學意義，說明共聚焦熒光圖像效果更好，與相關實驗研究結果類似。

近年新型的共聚焦系統推出超分辨率成像功能，使用超分辨率圖像重構成像新技術[11]。 超分辨率圖像重構是指通過硬件結合軟件方法，采集分析一系列低分辨率的圖像來得到一幅高分辨率的圖像過程，其是提高成像系統分辨率的一類技術[12，13]。CI 反卷積技術是一種圖像處理及圖像恢復的新技術，通過使用專業限制迭代算法，對于提高圖像的分辨率非常有效[14，15]。 本實驗顯示新型的超分辨率共聚焦系統可以準確獲取超分辨率圖像，與普通共聚焦系統相比，可獲取高倍數的蒿草樣本超分辨率熒光圖像。 使用軟件cellSens 的CI 反卷積功能處理，可獲得超分辨率反卷積圖像，與新型共聚焦系統超分辨率圖像比較，圖像更亮，熒光值增高，有統計學意義，可更清晰觀察到蒿草樣本切片的細微結構。

圖4 新型FV3000 共聚焦系統CI 反卷積獲取的蒿草切片超分辨率反卷積圖像（3000×）

表1 四組蒿草樣本不同染料染色熒光圖像熒光強度比較

本實驗采用樣本截面結構清晰的蒿草樣本[16]，使用超分辨率圖像重構與CI 反卷積共聚焦成像技術對蒿草樣本的熒光成像進行分析研究，結果表明超分辨率圖像重構與CI 反卷積共聚焦成像技術檢測生物組織樣本，采集超分辨率熒光圖像具有較高的使用價值。