輕型顱腦損傷患者血清miR-16 和miR-92a 的表達變化與預后的相關性研究

潘長福 ，段景麗 ，何燕 ，翁中海 ，余兆祥

（景德鎮市第一人民醫院1.神經外科；2.急診科，江西 景德鎮 333000）

創傷性顱腦損傷（Traumatic brain injury， TBI）是一類嚴重危害人類生命和健康的疾病。 據估計，我國腦外傷患者發病率為每年150～120/10 萬人[1]，其中輕型顱腦損 （mild traumatic brain injury， mild TBI）占比高達 75～90%[2]。 對于絕大多數輕型顱腦損傷患者而言，傷后無需特殊治療即可在數周至數月內恢復正常。 但約20%患者仍遺留有腦創傷后綜合征，如頭痛、頭昏、失眠、記憶力下降、焦慮、抑郁等，嚴重影響其正常工作和學習[3，4]。 盡管人們對輕型顱腦損傷越來越重視，但對其診斷與預后判斷仍缺乏有效手段。 在過去的幾十年中，許多蛋白分子被認為是有價值的顱腦損傷生物學標志物，如GFAP、NSE、UCH-L1、MBP 和S100B 等[5，6]。 然而，大部分蛋白分子對影像學正常的輕型顱腦損傷患者敏感性很低，迄今為止，還沒有任何蛋白類標志物運用于臨床[7]。 MicroRNAs (miRNA)為內源性非編碼單鏈小分子RNA，在轉錄后水平調節基因表達，參與調控多種生物學過程[8-11]。目前有研究發現，多種miRNA 在腦外傷后血清內表達水平發生明顯變化，具有潛在的生物學診斷價值[7，9，12]。 本文擬檢測輕型顱腦損傷患者血清miR-16 和miR-92a 的表達變化，探討其對輕型顱腦損傷患者診斷與預后評估的生物學價值。

1 資料與方法

1.1 資料收集 依據格拉斯哥評分 （Glasgow Coma Scale，GCS）系統，可以將創傷性顱腦損傷分為輕型GCS13～15 分、中型 GCS9～12 分和重型 GCS3～8 分[13]。 本研究收集 2018 年 6 月至 2018 年 12 月于景德鎮市第一人民急診外科和神經外科救治的輕型顱腦損傷患者GCS 評分13～15 分。病例判斷標準：⑴患者年齡＞18 歲，＜75 歲， 無合并其它系統損傷及既往無心、腦系統重大疾病史；⑵頭部外傷12h以內；⑶入院時GCS 評分13～15 分，且入院后GCS評分無降低；⑷排除受傷前患者有飲酒、使用毒麻和鎮靜藥物、精神、智力異常；⑸入院前未使用任何藥物治療者。 本研究經醫院醫學倫理委員會批準，并取得患者及家屬知情同意。

1.2 分組 入院時所有患者均于急診使用荷蘭飛利浦64 排128 層螺旋CT 進行頭顱掃描。 將顱骨及顱內未見明顯外傷性改變患者視為顱腦CT 陰性48 例。 發現以下任何情況均視為顱腦CT 結果陽性：單純顱骨骨折8 例、顱骨骨折合并硬膜外血腫6 例、硬膜下血腫6 例、蛛網膜下腔出血8 例、腦挫裂傷4 例。共收集患者80 例，將32 例顱腦CT檢查結果陽性者列為A 組，48 例顱腦CT 檢測結果陰性者列為B 組。 將同期本院體檢健康成人40例列為對照組。 三組人員性別、年齡差異無統計學意義（P＜0.01）。

1.3 標本采集 腦外傷患者入院后未行藥物治療前留取靜脈血5 ml，健康體檢者于空腹時留取靜脈血，離心后血清置于-80℃冰箱保存備用。

1.4 miR-16 和 miR-92a 檢測 采用 trizol 試劑盒提取血清內總RNA；以PrimeScript TM RT reagent kit 逆轉錄 RNA 為 cDNA，反應條件：42℃ 15min，85℃ 5s。 采用 miScript Primer Assays、miScript SYBR Green PCR Kit 反應體系，使用ABI 7500 real-time PCR system 中進行擴增反應。 反應條件：95°C，10min；95°C，15s，60°C，60s，40 個循環。 采用 U6 作為內參，健康體檢者血清為對照，用2-ΔΔCt表示基因的相對表達量。

1.5 GOSE 評分 所有患者于傷后6 個月進行GOS E 評分。 GOSE 評分分為 8 個等級：8 為恢復良好；7為恢復良好， 伴有輕微的身體和智力缺陷；6 為中等殘疾， 恢復以前的工作但需要一些調整；5 為中等殘疾，低水平的工作；4 為嚴重殘疾，依賴他人，可以做一些日常活動；3 為嚴重殘疾， 日常活動完全依賴他人；2 為植物狀態；1 為死亡。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0 軟件進行統計學分析。 計量資料以均數±標準差（±s）表示。 多組間均數比較采用單因素方差分析，兩組均數間比較采用小樣本t 檢驗。 采用Spearman 分析血清miR-16、miR-92a 表達量和 GOS-E 評分相關性。 P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較 腦外傷A 組、B 組和對照組年齡、性別差異無統計學意義；腦外傷A 組和B 組受傷至入院采血時間差異無統計學意義。 見表1。

2.2 各組血清miR-16 和miR-92a 表達量比較 腦外傷A 組和B 組miR-16 的表達量均明顯高于對照組，且腦外傷A 組miR-16 的表達水平明顯高于腦外傷 B 組。 同樣， 腦外傷 A 組和 B 組 miR-92a的表達量均明顯高于對照組，且A 組miR-16 的表達水平明顯高于B 組。 見圖1。

表1 腦外傷A、B 組和對照組的一般臨床資料

2.3 血清miR-16 和miR-92a 表達量與腦外傷患者傷后6 個月GOSE 評分的關系 Spearman 預后分析表明，腦外傷患者血清miR-16 和miR-92a 表達量與其預后呈負相關， 血清內miR-16 和miR-92a 表達量越高， 其預后越差 （r=-0.74、-0.65，P＜0.05）。 同樣，顱腦 CT 陽性 A 組患者和顱腦 CT 結果陰性B 組患者血清內miR-16 和miR-92a 表達量均與其預后呈負相關（r=-0.82、-0.75；r=-0.72、-0.69，P＜0.05）。 見表2。

圖1 Real-time PCR 結果顯示腦外傷 A 組和 B 組miR-16 和miR-92a 表達水平均明顯高于對照組（*P＜0.01）；A 組 miR-16 和miR-92a 表達水平明顯高于 B 組（#P＜0.01）

表2 血清miR-16 和miR-92a 表達量與腦外傷患者傷后6 個月GOSE 評分的關系

3 討論

目前輕型顱腦損傷診斷主要依據GCS 評分和影像學檢查，但二者皆有其特定的局限性。 GCS 評分無法適用于復合傷、飲酒、使用鎮靜劑、精神、智力異常等患者[14]。 CT 掃描是患者入院時首選檢查方法，但敏感性較低，大多數輕型顱腦損傷患者影像學檢查無異常表現。 磁共振成像可以提高對微小病灶的檢出率，但對設備要求高，費用高昂，外傷早期很難安排，限制了其廣泛使用[5]。因此尋找微創、快捷、價格低廉的生物學標志物，對于輕型顱腦損傷的診斷與治療具有重大意義。 目前，大量研究發現，許多蛋白分子，如 GFAP、NSE、UCH-L1、MBP 和S100B 等， 在腦外傷患者血清內含量明顯增加，并與腦外傷嚴重程度及預后相關[5]。 但是由于蛋白類分子標志物分子量大， 通過血腦屏障困難，特別是對于影像學正常的輕型顱腦損傷患者而言，特異性和敏感性很低。 因此，迄今為止，還沒有任何蛋白類標志物運用于臨床[5]。

miRNA 為小分子單鏈RNA，很容易通過血腦屏障，且在體液內含量豐富、性質穩定，人們已開始研究其在腫瘤、心血管疾病和神經退行性疾病等疾病診斷中的生物學標志物價值[8]。 同樣，miRNA作為腦外傷潛在的生物學標志物也引起人們重視。如 2010 年，Redell 等采用 RT-PCR 技術檢測 10位重型顱腦損傷患者和10 位輕型顱腦損傷患者外周血108 個miRNA 的表達水平，以正常成人和矯形外科創傷患者作為對照，結果發現輕、重型顱腦損傷患者外周血miR-16 和miR-92a 均發生明顯變化[12]。 2016 年，Bhomia 等采用 miRNA 芯片檢測輕、重型顱腦損傷患者血清和腦脊液標本，以矯形外科創傷組和健康人群作為對照，發現miR-451、 miR-20a 和 miR-92a 等 miRNA 在輕、 重型顱腦損傷患者血清和腦脊液內均表達明顯上調[7]。 同樣，周小龍等發現，輕、中、重型創傷性顱腦損傷患者血清內 miR-93、miR-191、miR-499 表達水平均顯著性上升， 且治療后臨床療效好患者血清miR-93、miR-191 和miR-499 水平顯著低于臨床療效差的患者[15]；薛全生等發現，腦外傷后，輕、中、重型顱腦損傷患者血清內 miR-93、miR-191 和 miR-499 表達水平也均明顯升高，且重型顱腦損傷組患者表達最高[16]。 以上研究表明，miRNA 作為一種潛在的生物學標志物，可能在腦外傷診斷與損傷程度評估中具有重要意義。

本研究檢測了輕型顱腦損傷患者傷后早期血清內miR-16 和miR-92a 的表達變化。 結果發現，與健康體檢者比較， 腦外傷4h 后CT 陽性患者和CT 陰性患miR-16 表達量分別為對照組的6.36 倍和 4.25 倍，miR-92a 的表達量分別為對照組的4.48 倍和 3.07 倍，均顯著增高。 Redell 等報道，在其研究中， 輕型顱腦損傷患者腦損傷后10h 內，血清內miR-16 和miR-92a 均上升 2.3 倍，與本研究結果類似；同樣，Bhomia[7]等檢測了輕型顱腦損傷患者傷后24h（平均時間為3.1h）血清內mi-92a 的表達水平， 結果發現其表達水平為健康對照組的3.77 倍，顯著上調，同樣與本研究結果類似。 本研究還發現顱腦 CT 陽性患者血清內 miR-16 和miR-92a 表達量比顱腦CT 陰性患者表達量明顯升高，提示腦外傷患者血清miR-16 和miR-92a 表達變化具有潛在的診斷價值。 此外，本研究發現，輕型顱腦外傷預后欠佳者（GOSE 評分＜8 分）血清miR-16 和miR-92a 表達水平較預后良好（GOSE評分8 分）者明顯增高，提示血清miR-16 和miR-92a 表達變化可作為輕型顱腦損傷預后的潛在生物學指標。 然而由于本研究納入研究樣本量相對較少，且miR-16 和miR-92a 在腦外傷中的具體功能及作用機制尚不明確，仍需要進一步研究。

綜上所述，本研究發現輕型顱腦損傷患者血清內miR-16 和miR-92a 表達水平升高，可作為輕型顱腦損傷診斷與預后的生物學標志物，具有潛在的臨床應用價值。