1，25(OH)2D3/VDR 對濕疹患兒 miRNA155/SOCS1通路的調節作用

江永青，汪紅，胡穎，胡志堅，詹忠明，何媛

（九江學院附屬醫院檢驗科， 江西 九江 332000）

濕疹，通常被稱為“特應性皮炎”，是一種表皮及真皮淺層的慢性炎癥，其在兒童中發病率遠高于成人，發病高峰期發病率可達到28.7%[1]。濕疹臨床可表現為慢性反復發作的皮膚瘙癢、干燥和疼痛，生活質量下降，甚至導致抑郁癥狀、社會隔離以及自我認同感下降等精神心理疾患，同時也為社會造成巨大的經濟負擔。 其發病機制尚不明確，目前認為與自身免疫功能和皮膚屏障功能有關。 近期研究顯示維生素D 經代謝形成的活性產物--維生素D3(，1，25-dihydroxyvitamin D3， 1，25(OH)2D3）與多種免疫相關性疾病有關，如哮喘、蕁麻疹、食物過敏等[2，3]。 而只有表達維生素 D 受體(vitamin D receptor，VDR）的組織器官才能有效發揮活性維生素D的作用。 此外， 1，25 (OH)2D3/VDR 是否通過 miRNA155/SOCS1 通路參與濕疹的發生， 尚不清楚。為此本實驗檢測濕疹患者 1，25 (OH)2D3、VDR、 miRNA155 及 SOCS1 表達量的變化，探討 1，25(OH)2D3/VDR 對濕疹患兒miRNA155/SOCS1 通路的調節作用，為濕疹的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 選取 2016 年 1 月-2018 年 7 月在九江學院附屬醫院就醫的濕疹患兒108 例，男性57 例，女性 51 例， 平均年齡 5.4±3.5 歲。 正常對照組 77例，均來自外科手術患兒，皮膚組織無病變，其中男 42 例，女 35 例，平均年齡 6.2±4.1 歲，其性別、年齡與患者相匹配。 濕疹患者的診斷及分期均符合趙辨主編的《中國臨床皮膚病學》第四版[4]。 入選實驗對象標準：⑴臨床醫生確診為濕疹的患者；⑵排除嚴重心肺功能不全和肝腎功能不全者； ⑶2周內未局部外用皮質類固醇激素、維生素D3 衍生物、鈣調磷酸酶抑制劑及免疫抑制劑;⑷近1 個月未系統應用糖皮質激素、補骨脂素、阿維A 等系統治療及日光浴、紫外線治療；⑸未合并皮膚真菌、病毒等感染類疾病或其他相關皮膚病患者;⑹無藥物過敏史；⑺符合倫理道德，遵循知情同意原則。

1.2 方法

取患者與健康對照組靜脈血5ml (促凝管)，采用羅氏Cobas 6000 自動生化免疫分析儀， 用電化學發光法檢測患者血清1，25(OH)2D3含量。 試劑盒由羅氏診斷公司提供。

取患者與健康對照組外周靜脈血50μl (EDTA抗凝)，采用流式細胞術檢測患者T 細胞百分比。 6 C-TBNK(美國 BD 公司， 批號:90646)避光孵育 20 min， 用含 0.5%BSA 的 PBS 洗 2 遍， 流式細 胞 儀(美國， BD FACSCanto TMII) 檢測。

取患者皮損處組織與對照組皮膚組織， 采用Trizol 法提取總 RNA，反轉錄合成 cDNA。 以 cDNA 為模板、 以 β-actin 為內參基因進行 RT-PCR反應。 采用實時熒光 PCR 儀(美國，A&B 7500 Real Time PCR System)檢測 VDR、miRNA155、SOCS1 及β-actin 表達。 引物均通過 GenBank 檢索得到：VDR F-5' ATGCCATCTGCATCGTCTC 3'，R-5'GCACCGCACAGGCTGTCCTA 3'；miRNA155 F-5'TAATGCTAATCGTGATAGGG3'，R -5'TTTGGCACTAGCACATT3'；SOCS1 F-5′ CTTCTGTAGGATGGTAGCACAC -3'，R -5′ AGGAAGAGGAGGAAGGTTCT-3'；β-actin F-5’ TGGCACCCAGCACAATGAA 3’，R-5’ CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA 3’。

1.3 統計學處理 實驗數據采用SPSS12.0 統計軟件包進行統計學處理， 運用均數±標準差±s 表示，進行方差分析， 計量資料比較方法采用SN—K 法兩兩比較。 RT-PCR 數據采用 2-△△ct法處理，將各基因的Ct 值減去β -actin 的平均Ct 值作為△Ct 值。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 濕疹患者與健康對照組血清1，25(OH)2D3濃度的變化 濕疹患者血清 1，25 (OH)2D3含量 29.25±11.03 nmol/L， 健康對照組為 55.49±21.66 nmol/L，濕疹患兒明顯低于健康兒童（P＜0.05）。

2.2 濕疹患兒淋巴細胞亞群的分析 結果顯示，濕疹患兒 T 細胞亞群（CD3+，%）及 CD4+的 T 淋巴細胞亞群（CD3+CD4+，%）明顯高于對照組，CD8+的 T淋巴細胞亞群（CD3+CD8+，%）明顯低于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 各組T 淋巴細胞亞群的比較（±s）

表1 各組T 淋巴細胞亞群的比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

CD3+(%)對照組濕疹患兒組64.47±17.23 68.65±16.74*CD3+CD4+(%) CD3+CD8+(%)33.25±11.95 38.83±10.82*29.01±7.93 25.68±6.81*CD4+/CD8+1.24±0.49 1.50±0.60*

2.3 濕疹患者 VDR 、miRNA155、SOCS1 基因的表達 與對照組相比，濕疹患者皮損處VDR 、SOCS1的表達明顯下降，miRNA155 的表達明顯上升 （P＜0.05），見表2。

表2 濕疹組和對照組 VDR 、miRNA155、SOCS1 表達水平比較（±s）

表2 濕疹組和對照組 VDR 、miRNA155、SOCS1 表達水平比較（±s）

注：與對照組比較 ， *P＜0.05

VDR對照組濕疹患兒組3.62±1.68 1.74±0.92*miRNA155 SOCS1 2.06±0.84 5.41±3.23*3.13± 1.70*1.78±1.02

2.4 濕疹患者血清1，25(OH)2D3濃度與各指標的相關性 濕疹患者血清 1，25 (OH)2D3濃度與 miRNA155 表達呈負相關（P＜0.05）， 與 VDR、SOCS1 表達呈正相關（P＜0.05)，見表3。

表3 濕疹患者血清1，25(OH)2D3 濃度與各指標的相關性

3 討論

濕疹造成濕疹樣皮損，產生劇烈瘙癢，患者焦慮，生活質量下降。 濕疹發病機制復雜，目前認為其病因可能與多種內外因素相關，如自身免疫系統功能失調、慢性皮膚感染、代謝紊亂、化學物質等[5]。 中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、免疫球蛋白和補體都是濕疹重要參與者[6]。

1，25 (OH)2D3屬脂溶性類固醇衍生物，是維生素D 家族最重要的成員。 維生素D 可抑制固有免疫及炎癥反應，調節皮膚屏障功能，這在濕疹的發病機制中至關重要。 維生素D 可以通過多種途徑影響免疫系統的調節。 在針對類風濕關節炎患者的實驗中，研究人員發現1，25(OH)2D3可通過調節Th1和 Th17 的平衡，起到免疫調節作用[7]。 此外，研究人員在自身免疫性甲狀腺疾病的研究中發現， 抗甲狀腺過氧化物酶抗體與血清25-羥基維生素D 之間存在顯著的負相關關系。 TPOAb 陽性在維生素D 缺乏者中更為普遍[8]。 活性維生素D 生物活性的表達依賴于維生素D 受體的存在。 研究人員在小鼠濕疹模型的試驗中發現，低鈣狀態VDR 未被激活，使得濕疹的癥狀明顯加重。在經過VDR 激動劑治療的小鼠皮膚中，有Foxp3 表達的調節T 細胞明顯增多，且皮膚屏障基因和抗菌肽基因明顯增強[9]。

在皮膚屏障功能方面，維生素D 及其受體可調節基底層的增殖，調控棘層和顆粒層蛋白，并調控角質層脂質的合成[10]。 因此，維生素D 可通過改變表皮屏障功能、免疫失調和細菌防御不足來調節過敏反應。 微小 RNA(microRNA，miRNA)是一類豐富的非編碼RNA，由于其調節基因表達的能力，在許多生物過程中起著重要的作用。 多種miRNA 參與調節免疫、自身免疫和預防[9]。 其中，miRNA155 是現有研究中發現的免疫反應的重要調節基因。 許多免疫細胞的刺激可以引起miRNA155 的顯著升高[11，12]。 研究發現，在哮喘變化期間，可能通過 miRNA133 和miRNA155 的調節，間充質干細胞，而非條件培養基在減少病理變化中的潛在作用[13]。miRNA155 可上調 T 細胞和 B 細胞的活性[14，15]。 據報道，缺乏miRNA155 的B 細胞反性應降低，不能產生高親和力的抗體免疫球蛋白（Ig）[16]。 SOCS1 是重要的負性調節因子，在調節性T 細胞的增殖及發揮其功能中起作用，這可阻止自身活性T 細胞的增殖及效應器功能，從而維持自身抗原對外周的耐受性[17]。Treg 細胞中 CD4、CD25 和 Foxp3 的表達為陽性，這是它們發育和發揮功能所必需的。 SOCS1 可阻止Treg 產生炎癥細胞因子，在沒有SOCS1 的情況下，Tregs 失去Foxp3 的表達，并成為致病性T 細胞[18]。 此外，microRNA-221 通過靶向 SOCS1/NF-κB途徑來促進I 型干擾素的產生，從而限制了人類巨細胞病毒（HCMV）的復制[19]。 在小鼠的肺癌模型中研究者證實，MicroRNA-30a 可通過SOCS1 控制誘導型 CD4+Treg 的不穩定性[18]。 而 1，25(OH)2D3可通過 miRNA155-SOCS1 通路負反饋調節 TLR 信號，從而調節機體免疫功能。 2017 年Kempinska-Podhorodecka A 等[20]在對免疫相關性疾病原發性膽汁性膽管炎， 降低VDR 表達可通過miRNA155-SOCS1 通路影響機體免疫功能。

本實驗通過檢測濕疹及對照組兒童的相應指標發現，濕疹患兒 1， 25(OH)2D3、VDR 明顯下降，而miR-155 明顯上升，同時伴隨 SOCS1 的下降。 提示1，25 (OH)2D3、VDR 可 能 通 過 靶 向 miRNA155-SOCS1 限制炎癥反應。 當 1，25(OH)2D3/VDR 不足，將導致其誘導的信號傳導受損，誘發免疫炎癥的發生。 1，25 (OH)2D3/VDR 的下降， 負反饋調節 miR-155，使其表達上升，而過度表達的 miR-155 造成對 SOCS1 的抑制，使SOCS1 下降。