HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 檢測灰區(qū)設置范圍及其必要性探討

李玉，熊麗紅，蔡縣成

（1.江西省血液中心，江西 南昌 330077；2.上饒市中心血站，江西 上饒 334000）

ELISA 作為一種免疫技術，由于生物學標本中存在各種干擾實驗和影響結果的因素，有部分血液標本測定的吸光度值，達不到試劑盒規(guī)定判斷陽性的臨界值（Cut-off）水平，特別是接近Cut-off 值的結果，很難判斷其是否攜帶某些病原體的抗原或抗體[1]，研究者將其定義為灰區(qū)。 目前國內對灰區(qū)臨界值設置并無統(tǒng)一標準，若灰區(qū)設置范圍過窄，則存在一定輸血感染風險，無法確保血液安全；若范圍設置過寬，則會造成不必要的血液報廢，影響固定獻血者隊伍的建立，那么有無必要設置灰區(qū)以及灰區(qū)范圍如何設置，一直是實驗室討論的焦點。 為此，本文針對酶免檢測0.5≤S/CO＜2.0 范圍內標本進一步核酸檢測，并分區(qū)段進行統(tǒng)計分析，具體結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 取本中心 2018 年 4 月 1 日-2019年6 月30 日無償獻血者血液標本86314 人份與上饒地區(qū) 2018 年 4 月 1 日-2019 年 1 月 31 日血液標本 36831 人份，進行 HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、梅毒抗體常規(guī)酶免檢測，收集S/CO 值在0.5≤S/CO＜2.0 區(qū)間的試驗樣本，進行分段統(tǒng)計分析（0.5≤S/CO＜0.8，0.8≤S/CO＜1.0，1.0≤S/CO＜2.0）， 后統(tǒng)一進行核酸單檢實驗。

1.2 儀器與試劑 采用STAR 全自動加樣儀 （深圳愛康），F(xiàn)AME 全自動酶免分析系統(tǒng)（澳斯邦），血液核酸檢測儀器： 全自動核酸提取儀 （COBAS AmpliPrep）、全自動核酸擴增儀（COBAS TaqMan（瑞士羅氏公司）。 ELISA 檢測試劑(廈門新創(chuàng)，北京萬泰， 質控物均為康徹斯坦)； 核酸檢測試劑盒:COBAS TaqScreen MPX V2.0 test 核酸檢測試劑盒(瑞士羅氏有限公司），所有試劑批批檢合格，均在有效期內使用。

1.3 標本處理 由采血人員完成標本留取， 其中1管(帶分離膠EDTA-K2 抗凝)用于核酸檢測，另1管(EDTA-K2 抗凝)用于血清學檢測。 所留標本置2～8℃冰箱保存， 酶免測定后 0.5≤S/CO＜2.0 標本對應核酸管置于-20℃冷庫保存， 便于統(tǒng)一進行試驗。

1.4 研究方法 ⑴期間所有血液標本先進行酶免四項檢測，初復檢均陰性標本進行核酸六混樣模式進一步確證；⑵留取乙肝、丙肝、艾滋酶免檢測單試劑、雙試劑結果S/CO 值在0.5～2.0 范圍標本，進行核酸單檢模式確證， 因NAT 實驗提取的是病毒的DNA 或RNA，故梅毒項目另行采取其他方法確證。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用統(tǒng)計軟件SPSS17.0， 采用卡方檢驗 （chi-square test），P 小于 0.05 有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2018.4.1-2019.6.30 期間根據(jù) ELISA 檢測結果，共留取 HBsAg、抗-HCV、抗-HIV 0.5≤S/CO＜2.0 范圍標本數(shù)各 89、89、12 人份。 其中，核酸單檢試驗結果顯示，有反應結果數(shù)10 人份，均為HBVDNA，未檢測出 HCV-RNA 和 HIV-RNA 陽性，將乙肝核酸單檢結果與丙肝、艾滋單檢結果比較，經卡方檢驗，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.005)。 見表1。

表1 各項目S/CO 分段樣本數(shù)及核酸單檢陽性數(shù)

2.2 10 人份標本酶免初復檢結果顯示，單邊0.5≤S/CO＜0.8（萬泰復檢）共計 3 人份；0.5≤新創(chuàng)試劑＜0.8、0.8≤萬泰試劑＜1.0 共計 2 人份；0.5≤新創(chuàng)試劑＜0.8、1.0≤萬泰試劑＜2.0 （單邊陽性） 共計 3 人份，雙邊試劑陽性（S/CO≥1.0）共計2 人份，分別占分段內總數(shù)百分率為16.7%、8.7%、10.4%，三區(qū)段內陽性數(shù)百分比，三者差異不明顯，無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。 見表2，表3。

表2 NAT 陽性樣本雙試劑S/CO 值及核酸檢測CT 值對比

表3 HBV 各區(qū)段樣本總數(shù)及NAT 單檢陽性數(shù)百分比

3 討論

ELISA 主要檢測血漿中存在的傳染性標志物抗原、 抗體， 但由于不同試劑盒陽性判斷臨界值(Cut-off）存在差異；病毒感染存在窗口期；病毒變異后表達產物含量低以及個體差異等，以及各種干擾實驗和影響結果的因素，給其應用帶來了一定的局限性。 血清學篩查雖已極大程度降低了經輸血和血制品感染病毒的風險，但仍未完全消除，其中，最主要的風險就是血清轉換窗口期的漏檢[2]。 NAT檢測的是病毒的DNA 或RNA，敏感性較高，可有效縮短病毒感染的窗口期檢測時間， 相關研究表明，通過核酸檢測可將HBV、HCV 和HIV 感染的平均“窗口期”縮短至 9、59 和 11d，此外 NAT 還可檢測出因病毒變異、 隱匿性感染等原因而漏檢的污染血液。 由此可降低或減少ELISA 漏檢導致的輸血殘余風險的發(fā)生，進一步保障臨床供血安全[3，4]。

本研究中，S/CO 在 0.5～1.0 區(qū)間內乙肝、丙肝、艾滋標本數(shù)分別為41、28、3 人份，由此可以看出乙肝項目灰區(qū)標本占比最多，這從側面印證了部分血清HBsAg 呈低水平狀態(tài)存在[5]，極易出現(xiàn)弱反應性結果，當然也不排除實驗過程中受各種不確定因素干擾引起的臨界值樣本存在;其中艾滋項目灰區(qū)標本數(shù)最少，丙肝居中。 從后續(xù)核酸單檢實驗數(shù)據(jù)來看， 均為 HBV 有反應性，0.5≤萬泰單試劑＜0.8 陽性數(shù)3 人份，雙邊試劑均未超過CO 值陽性標本數(shù)5 人份，占本研究總陽性數(shù)50%，說明臨床用血經常規(guī)篩查后出現(xiàn)輸血傳播疾病的風險主要為HBV感染，而且最有可能就是隱匿性 HBV 感染(OBI)[6，7]。丙肝、艾滋（0.5≤S/CO＜2.0）均未檢出陽性，這與本站艾滋病確證實驗室結果基本相符。

從核酸單檢陽性的CT 數(shù)值看，循環(huán)數(shù)35 以內占 6 人份，35 以上 4 人份。 盡管 NAT 從理論上并不能完全消除感染“窗口期”，但病毒核酸轉陽之前的血液傳染性極低，可以有效地預防經輸血傳播病毒性疾病[8]。 由于灰區(qū)標本在日常標本中占比極少，且還要鑒別明顯因人為操作、拖帶、污染等因素導致的假性弱反應標本，收集零散樣本后還需經過冷凍與復融等過程，所以完成整個檢測周期需較長時間[9，10]，另外病毒的核酸檢測依賴于樣本中的病毒顆粒數(shù)量，并可能受到樣本采集方法、患者因素（例如年齡、是否存在癥狀）和/或感染狀況等影響，建議核酸單檢后做進一步的跟蹤篩檢確證試驗，有條件情況下能盡可能多的收集符合要求樣本進行相關試驗，提供數(shù)據(jù)支持，以期最大限度確保試驗結果的可靠性，這是后續(xù)階段我們需要改進之處。

由本研究可見，對于血站系統(tǒng)而言，酶免檢測設置適當?shù)幕覅^(qū)范圍非常必要，HBsAg 項目建議嚴格“灰區(qū)”設置范圍，可設置為0.5～0.8 倍S/CO值，特別對于酶免檢測雙試劑S/CO 值大于0.5、小于1.0 可疑標本，條件允許時應進行核酸單檢試驗，確保血液安全;而抗-HCV、抗-HIV 在 S/CO 值 0.5～2.0 范圍內NAT 單檢均未有陽性檢出，二者建議可不設置灰區(qū)，若設置“灰區(qū)”，則可能造成一定的血液浪費。 因此，各實驗室可根據(jù)自身使用試劑情況及當?shù)亓餍胁W情況綜合平衡考慮，制定科學合理的灰區(qū)設置范圍[11-16]。