葉面噴施S-烯丙基-L-半胱氨酸對晚稻籽粒中鉛含量的影響

程六龍，黃永春*，周桂華，劉仲齊，張長波，王常榮，王曉麗

（1.農業農村部環境保護科研監測所，天津300191；2.廣西蘭池環保科技有限公司，南寧537000）

人類工、農業生產活動直接或間接地向環境中排放了大量含鉛（Pb）污染物，其中大部分留存于土壤表層[1]。農田土壤中的Pb 可以通過土壤-植物-食物的傳遞過程最終轉移到人體內[2]，通過體內循環系統分布到肝臟、腎臟和肺等多個器官并在這些器官中逐步蓄積，從而給人體健康造成潛在風險。20 世紀80年代，有關Pb 攝入對兒童神經系統影響的研究被大量報道后，Pb 污染問題開始受到世界各國科學家的廣泛關注[3]。2006年，國際腫瘤研究協會（IARC）進一步將無機Pb 及其化合物劃分為2A 類致癌物（可能對人體具有致癌活性）[4]。鑒于Pb 對人體的毒害作用，世界各國都對食品中Pb含量制定了相關限量標準。

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，種植范圍覆蓋全球100 多個國家。全球超過一半的人口以稻米為主糧，稻米為全球人口提供了21% 的總攝取熱量，而在東南亞地區這一占比甚至高達76%[5]。稻米中的Pb 主要來源于水稻根系從土壤中吸收的Pb，小部分可能來源于大氣降沉到水稻葉面的Pb[6]。為保護人體健康，我國國家食品安全限量標準（GB 2762—2017）規定大米中的Pb 含量不得高于0.2 mg·kg-1。為降低水稻籽粒中的Pb含量，目前已開發出多種農藝措施，如使用有機或無機改良劑[7]、水分調控[8]、肥料利用[9]都可以起到降低水稻籽粒中Pb 含量的作用。此外，也有報道表明葉面噴施礦質營養元素如硅（Si）、硒（Se）也可以降低水稻籽粒中的Pb 含量[10]。隨著無人機噴施技術的快速發展，葉面噴施技術的田間應用成本迅速降低，這使得該技術的大面積推廣應用成為可能。近年來，葉面噴施技術在水稻重金屬污染防治，尤其是鎘（Cd）污染防治方面已經成為研究熱點[11]，并顯示出良好的應用前景。但是，重金屬葉面阻控劑的研究主要集中在對無機元素的篩選與利用方面，而對有機化合物尤其是含硫化合物的報道較少。本研究選擇Pb含量較高的水稻田塊作為試驗區，研究了葉面噴施S-烯丙基-L-半胱氨酸（SAC）對水稻籽粒中Pb含量的影響。

SAC是大蒜提取物中的一種天然有機硫化合物，其對保障人體健康具有諸多益處，包括預防心血管疾病、肝臟疾病和神經發育系統疾病[12-13]。此外，還有報道表明SAC 可顯著降低Pb2+對紅細胞的毒性，延長暴露于Pb2+環境中的紅細胞壽命[14]。SAC結構中含有一個二硫鍵，其斷裂后形成的巰基可與Cd、As、Pb 等重金屬形成穩定的螯合物，緩解重金屬對植物和人體造成的毒害[15]。在醫療上，針對Pb2+中毒通常采用2，3-二巰基丁二酸（DMSA）進行螯合法治療[16]。我們前期研究表明，于水稻開花期葉面噴施DMSA 可以顯著降低累積在營養器官尤其是旗葉中的Cd2+向籽粒中遷移，顯著降低籽粒Cd 含量[17]，顯示出巰基重金屬螯合劑在降低稻米重金屬含量方面具有巨大的潛在應用價值。有研究表明，SAC在緩解重金屬毒性方面甚至優于DMSA[18]。本研究分別于水稻孕穗期和開花期各噴施一次SAC，主要探究：（1）葉面噴施SAC對水稻籽粒Pb含量的影響；（2）葉面噴施SAC 對水稻籽粒中人體必需礦物營養元素（K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn）含量的影響；（3）葉面噴施SAC 對Pb在水稻體內遷移轉運的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與試驗材料

試驗區選在廣西壯族自治區桂平市（23°24′N，110°03′E），試驗所選稻田位于某小型廢棄鉛鋅礦下游。試驗田土壤類型為水稻土，其理化性質如表1所示。

水稻品種選用當地主栽優質稻品種“百香139”，種子購于當地種子公司。S-烯丙基-L-半胱氨酸（SAC）為分析純，購于國藥集團。

1.2 試驗方法

水稻于2019 年6 月12 日開始育秧，幼苗于2019年7月26日移植。小區面積設定為10.0 m2（長5.0 m、寬2.0 m）。采用當地傳統生產管理方法進行田間管理，采用化學除草劑除草，噴施化學農藥進行田間防病、防蟲。

稱取適量的SAC溶于田間灌溉水中，并加水稀釋至1.0 L，配 制 成0.05、0.1、0.2、0.3 mmol · L-1和0.4 mmol·L-1的SAC水溶液，另設不加SAC的處理作為對照（CK），每個處理3 次重復。分別于2019 年8 月15日、8 月23 日水稻孕穗期和開花期階段，用手持式噴霧器將SAC水溶液均勻噴灑于水稻植株的葉片表面，全生育期內共噴施2次。

表1 水稻種植前表層土壤的物理化學特性Table 1 The physicochemical properties of the top soils before planting rice

1.3 樣品的采集與處理

于水稻成熟期，每個小區隨機取3 株水稻完整植株。室溫自然晾干后，用剪刀將根系與地上部植株分開，將地上部植株分為籽粒、穗軸、第一節間、旗葉、第一節、第二葉、第二節、第二節間、第三節間，共10 個部分。去離子水沖洗3次，70 ℃下烘干72 h。

籽粒用礱谷機脫殼后獲得糙米，用萬能粉碎機磨成粉末，備用。

地上部植株樣品及根系樣品經剪刀剪碎后，用萬能粉碎機磨成粉末，備用。

1.4 土壤理化性質的測定

于水稻種植前，采用多點隨機取樣法采集試驗區土壤樣品，常溫下風干，磨碎過0.15 mm 篩，參照文獻報道方法測定土壤理化性質和土壤中重金屬的含量[19]。簡述如下：用pH 計測定土壤的pH 值，用滴定法測定土壤有機質，用NH4OAc 法測定陽離子交換量（CEC）。消解后土壤樣品用ICP-MS（ICP-MS，Agilent 7500a，USA）測定Pb和其他金屬元素含量。

1.5 糙米及植株樣品中Pb及礦質營養元素的測定

分別于消解管中稱取磨成粉末后的植物樣品約0.25 g，加入7 mL MOS 級濃硝酸浸泡8 h，將消解管放入電熱消解儀（Digi Block ED54）進行消解，110 ℃加熱消解2.5 h后冷卻至室溫，加入1 mL過氧化氫搖勻，110 ℃繼續加熱1.5 h，最后于170 ℃將消解管內的液體濃縮至0.5 mL 以內，去離子水稀釋至10 mL 后轉移至25 mL 容量瓶中并定容，用ICP-MS 測定消解液中Pb 以及礦質營養元素K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn 的含量。本測定方法對7 種元素的回收率為95%～105%，檢出限為0.3～5.5 μg·kg-1。

1.6 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 進行相關數據計算與處理。利用SPSS 22.0 進行統計分析，用極差法（Duncan′s）進行多重比較、差異顯著性檢驗。利用Origin 2019作圖。

2 結果與分析

2.1 噴施SAC 對水稻籽粒及不同營養器官Pb 含量的影響

利用ICP-MS 測定水稻籽粒和其他器官中Pb 含量，結果如圖1A 和圖2所示。由圖1A 和圖2可見，隨著SAC 噴施濃度的增加，籽粒中Pb 含量呈現出逐漸降低的趨勢。當SAC噴施濃度為0.05 mmol·L-1時，水稻籽粒中Pb含量與對照無顯著差異；當SAC葉面噴施濃度達到0.1 mmol·L-1時，水稻籽粒中Pb 含量與對照相比出現顯著降低，降幅高達34.04%；當SAC 噴施濃度繼續升高直至0.4 mmol·L-1時，籽粒中Pb 含量均未出現持續顯著降低的趨勢。綜上可見，葉面噴施0.1 mmol·L-1的SAC即可顯著降低水稻籽粒中Pb含量。

水稻各營養器官中Pb 含量的變化趨勢如圖1B～圖1J和圖2所示。由圖1B和圖2可見，當SAC噴施濃度為0.05 mmol·L-1時，與對照相比穗軸中Pb 含量變化不顯著；當SAC噴施濃度達到0.1 mmol·L-1時，穗軸中Pb含量出現顯著降低，降低幅度達到49.71%；隨著SAC 噴施濃度持續增加，穗軸中Pb 含量出現顯著增加趨勢，但是當SAC 噴施濃度超過0.3 mmol·L-1后穗軸中Pb 含量增加趨勢不顯著；當SAC 噴施濃度達到最高的0.4 mmol·L-1時，穗軸中Pb 含量與對照相比降低30.58%。地上部其他器官中Pb含量變化趨勢與穗軸中Pb 含量變化趨勢類似，均表現為SAC 噴施濃度大于0.1 mmol·L-1時，器官中Pb 含量反而出現持續升高趨勢。

圖1 水稻籽粒及不同器官中的Pb含量Figure 1 The Pb concentration in grains and organs

圖2 噴施SAC對水稻各器官中Pb含量的影響Figure 2 Effect of spraying SAC on Pb content in rice organs

由圖1H 和圖2 可見，水稻植株地上部頂端第二節中的Pb含量最高，對照組Pb含量為53.19 mg·kg-1，噴施0.1 mmol·L-1SAC 后，Pb 含量下降44.90%；其次是第一節（圖1E、圖2），對照組Pb 含量為32.14 mg·kg-1，噴 施0.1 mmol · L-1的SAC 后 ，Pb 含 量 下 降 了47.73%；第三節間（圖1I、圖2）中Pb含量排第三，對照組Pb 含量為29.60 mg·kg-1，噴施0.1 mmol·L-1的SAC后，Pb 含量下降22.16%；第二節間（圖1G、圖2）Pb 含量低于第三節間，第二節間中對照組Pb 含量為22.09 mg · kg-1，噴 施0.1 mmol · L-1SAC 后 ，Pb 含 量 下 降59.85%。旗葉（圖1C、圖2）中Pb 含量排第五，對照組Pb 含量為14.41 mg·kg-1，噴施0.1 mmol·L-1SAC 后，Pb 含量下降44.21%。第二葉（圖1F、圖2）Pb 含量次于旗葉，對照組Pb 含量為12.44 mg·kg-1，噴施0.1 mmol·L-1SAC 后，Pb 含量下降40.03%。第一節間（圖1D、圖2）Pb 含量小于第二葉，對照組Pb 含量為5.35 mg · kg-1，噴 施0.1 mmol · L-1SAC 后 ，Pb 含 量 下 降59.81%。根系（圖1J、圖2）中Pb 含量最高，噴施不同濃度SAC對根系Pb含量無顯著影響。

2.2 噴施SAC對籽粒中6種礦質營養元素含量的影響

由圖3可見，水稻籽粒中礦質營養元素K、Mg、Ca含量遠高于Mn、Fe、Zn 含量，且K 含量最高。葉面噴施SAC 對籽粒中K、Mg、Ca、Fe、Zn 5 種人體必需營養元素含量無顯著影響，但顯著降低了籽粒中Mn 的含量。當SAC噴施濃度達到0.1 mmol·L-1時，籽粒中Mn含量即出現顯著降低，與對照相比降低幅度達到21.93%，但是隨著SAC 噴施濃度的持續增加，籽粒中Mn含量并未出現持續顯著降低趨勢。

2.3 噴施SAC對水稻不同器官間Pb轉移系數的影響

由圖4A可見，噴施0.1 mmol·L-1的SAC顯著增加了Pb 由穗軸到籽粒的轉移系數（TF籽粒/穗軸），增加幅度達到22.40%，隨著SAC 噴施濃度的增加，TF籽粒/穗軸表現出逐漸降低趨勢，當SAC濃度達到0.3 mmol·L-1時，TF籽粒/穗軸降低至與對照無顯著差異。與之相似，噴施0.1 mmol·L-1的SAC 也顯著增加了Pb 由第一節間到穗軸的轉移系數（TF穗軸/第一節間），增幅為25.35%，但是隨著SAC 噴施濃度繼續增加，各噴施濃度間TF穗軸/第一節間增加幅度差異不顯著。

由圖4B 可見，噴施0.1 mmol·L-1的SAC 顯著增加了旗葉到籽粒的轉移系數（TF籽粒/旗葉），增加幅度達到16.35%，但是隨著SAC 噴施濃度繼續增加，TF籽粒/旗葉也表現出逐漸降低的趨勢。噴施SAC 對Pb 由第二節間向第一節的轉移系數（TF第一節/第二節間）無顯著影響。

圖3 水稻籽粒中礦質元素含量Figure 3 The mineral element content in rice grain

圖4 不同器官間Pb的轉移系數Figure 4 Pb transfer factor between different organs

由圖4C 可見，噴施SAC 對Pb 由第二節向第二節間的轉移系數（TF第二節間/第二節）和由第二節向第二葉的轉移系數（TF第二葉/第二節）均未造成顯著影響。

由圖4D 可見，噴施SAC 顯著降低了Pb 由第三節間向第二節的轉移系數（TF第二節/第三節間），最高降低幅度達到29.77%，而且0.1～0.4 mmol·L-1SAC 噴施濃度間的TF第二節/第三節間并未表現出顯著差異。與之相似，噴施SAC 后Pb 由根向第三節間的轉移系數（TF第三節間/根）也 出 現 顯 著 降 低 ，最 高 降 低 幅 度 達24.26%，隨著SAC 噴施濃度升高，TF第三節間/根也出現升高趨勢，但是當SAC 噴施濃度達到最高0.4 mmol·L-1時，TF第三節間/根仍與對照存在顯著差異。

3 討論

在目前已開發的降低水稻籽粒重金屬含量的農藝調控措施中，葉面噴施技術與土壤固化技術、植物修復技術、水肥調控技術等相比，具有操作簡單、價格低廉的優點。特別是無人機噴施技術在我國廣泛應用的背景下，葉片噴施技術的成本進一步大幅降低。目前葉片噴施技術在降低水稻籽粒中Cd含量研究方面取得了眾多研究成果。多項研究表明，在營養生長或生殖生長階段噴施Si[20]、Se[21]、Zn[22]等礦質元素可以有效降低水稻籽粒中重金屬Cd 含量。同時，有研究表明葉面噴施技術也可顯著降低籽粒中Pb 的含量[23]。當前葉面阻控劑有效成分的篩選研究主要集中在篩選不同的礦物質營養元素，通過離子拮抗機制降低有毒重金屬元素被轉運進水稻籽粒中[24]。該類重金屬葉面阻控劑不僅可以顯著降低水稻籽粒中重金屬含量，而且還具有二次環境污染風險較低的優點。此外，楊曉蓉等[17]報道，葉面噴施巰基重金屬螯合劑二巰基丁二酸（DMSA），通過在營養器官中與Cd2+形成螯合物也可顯著降低水稻籽粒中Cd含量，表明含硫巰基化合物可能是一類新型高效重金屬葉面阻控劑。

本研究分別在孕穗期和開花期葉面各噴施一次，含硫化合物SAC 顯著降低了水稻籽粒中Pb 含量，而且僅噴施濃度為0.1 mmol·L-1的SAC即可使水稻籽粒中Pb 含量顯著降低34.04%。在水稻營養生長階段，從根部吸收的重金屬被轉運到地上部營養器官如葉片、節間、節等中，在生殖生長階段儲存在營養器官中的重金屬隨營養物質一起被轉運進籽粒[25]。于水稻灌漿期噴施含硫的巰基化合物DMSA，其通過與Cd2+形成螯合物顯著降低了Cd 向籽粒中的遷移[17]。本研究中噴施0.1 mmol·L-1的含硫化合物SAC后也顯著降低了水稻籽粒中Pb 含量，但是隨著SAC 噴施濃度的繼續增加并未出現籽粒中Pb 含量持續降低的趨勢，Pb 由旗葉向籽粒中的遷移系數（TF籽粒/旗葉）反而增加。上述結果表明，噴施SAC 降低籽粒中Pb 含量的機制不同于噴施DMSA，預想的SAC 化學結構中含有的二硫鍵斷裂形成巰基，巰基與Pb 形成螯合物降低Pb2+向籽粒中的移動性并不是導致籽粒中Pb含量降低的主要原因。

有研究表明SAC 是一種重要的細胞轉錄因子調控劑，它在細胞內可以激活調控細胞抗氧化系統的Nrf2 轉錄因子，使細胞大量合成抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD），清除細胞內由于外界脅迫因素產生的大量自由基[26]。在水稻生殖生長階段，重金屬離子在轉運蛋白作用下被運輸到水稻籽粒中，對水稻的正常生理代謝過程造成了一定的脅迫效應。噴施低濃度（0.1 mmol·L-1）的SAC很可能起到了調控Pb2+轉運蛋白轉錄的作用，從而降低了籽粒中Pb 含量，但是其詳細調控機制仍有待進一步深入研究。

水稻中含有多種人體必需礦質營養元素如K、Mg、Ca、Fe、Mn、Zn 等[27]。這些必需元素在人體中具有重要的生理功能，缺Fe 會導致人體血紅蛋白數量降低，免疫力下降；成人缺Zn 可引發尿毒癥、貧血等癥狀，兒童缺Zn 會導致生長遲緩；成人缺Mn 則會導致生殖功能紊亂，幼兒及青少年缺Mn 會導致骨骼畸形、發育不良等[28]。本研究結果表明，噴施SAC 對水稻籽粒中人體必需礦質營養元素K、Mg、Ca、Fe、Zn 的含量沒有顯著影響，但是在降低籽粒中Pb 含量的同時也顯著降低了籽粒中Mn 的含量。有研究表明，重金屬Cd 與Mn 在水稻體內共用OsNramp5 轉運蛋白，當敲除該轉運蛋白編碼基因后，水稻籽粒中Cd 和Mn的含量同時出現顯著降低[29]。當在水稻開花期葉面噴施巰基化合物DMSA 后，水稻籽粒中Cd 和Mn 也出現同時降低的現象[17]，推測可能與影響OsNramp5 表達有關。關于Pb 在水稻體內的轉運蛋白報道較少，本研究中噴施SAC 后水稻籽粒Pb 和Mn 含量出現同時降低現象，是否也與OsNramp5 轉運蛋白表達有關需要進一步研究。此外，有研究表明在釀酒酵母中Pb 能與谷胱甘肽形成復合物（GS-Pb），從而緩解了Pb 對釀酒酵母的脅迫作用[30]。在ABCC 轉運子的運輸下，GS-Pb 復合物被轉運進液泡并被分隔在液泡內[31]。在擬南芥的根細胞中也發現了類似過程，Pb與谷胱甘肽結合后可通過AtHMA3轉運子轉運到液泡，降低了Pb 向地上部的轉運[32]。以上研究提示，噴施低濃度SAC 也可能誘發Pb在水稻根系中被運輸到液泡內封存從而起到降低Pb 向地上部運輸的作用，導致水稻地上部營養器官以及籽粒中的Pb含量均出現顯著降低。但是SAC 降低水稻籽粒及營養器官中Pb含量的機制仍需進一步深入研究。

有研究表明，水稻地上部Cd 含量最高的器官位于莖稈頂端第一節，這對阻止Cd 向籽粒中遷移起著重要作用[19，33]。本文對水稻地上部各器官中Pb 含量的研究表明，基部節和節間中Pb 含量表現出高于頂端節和節間中Pb 含量的現象，Pb 在水稻莖中的分布呈現出從基部到頂端逐漸降低趨勢。這一現象表明，重金屬Pb在水稻體內的運移性低于Cd。

4 結論

（1）分別于水稻孕穗期和開花期各噴施一次0.1 mmol·L-1SAC即可顯著降低水稻籽粒中Pb的含量，繼續增加SAC 的噴施濃度不會導致籽粒中Pb含量持續降低。

（2）分別于水稻孕穗期和開花期各噴施一次SAC，對水稻籽粒中K、Mg、Ca、Fe、Zn 5 種人體必需營養元素含量無顯著影響，但是會顯著降低籽粒中Mn元素含量。

（3）噴施SAC 顯著降低了Pb 由根向第三節間的轉移系數（TF第三節間/根）和由第三節間向第二節的轉移系數（TF第二節/第三節間）。