施用雞糞有機肥對種植小油菜土壤微生物群落結構多樣性的影響

李可，孫彤，2，孫濤，3，徐應明，孫約兵*

（1. 農業農村部環境保護科研監測所，農業農村部產地環境污染防控重點實驗室，天津市農業環境與農產品安全重點實驗室，天津300191；2.東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱150030；3.新疆農業大學草業與環境科學學院，烏魯木齊830052）

土壤微生物是農田生態系統中最活躍的一部分，通常作為土壤環境發生變化的指示物[1]，可反映土壤的健康程度[2]，已成為目前生態農業研究的熱點之一。土壤微生物對人為因素的干擾極其敏感，其中施用有機肥不僅可以影響土壤肥力和理化性質[3]，而且還會引起土壤微生物結構和多樣性的變化。隨著研究的深入，越來越多的方法應用于土壤微生物研究當中，其中磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acid，PLFA）分析法可以定量地反映不同類群活體微生物的量、微生物總量和群落結構等信息[4-5]，具有分析速度快、方法簡單、穩定性好等特點，因此在土壤微生物多樣性分析中得到了廣泛應用[6-7]。白震等[8]在種植玉米的農田上研究發現，與單施化肥相比，施用豬糞有機肥和豬糞有機肥化肥配施均有效地提高了土壤氮磷鉀等養分的含量，土壤真菌、細菌的PLFA 含量顯著增加。李金嵐等[9]針對種植玉米的土壤進行研究，指出不同施肥處理中，化肥+有機肥（雞糞）處理可明顯增加土壤微生物總PLFA 的含量，主成分分析結果顯示，化肥+有機肥處理的微生物群落結構相較于不施肥和施化肥處理變化較大。張恩平等[10]通過研究種植番茄土壤的微生物發現，配施有機肥（馬糞）可提高番茄根際土壤微生物群落功能多樣性，其中豐富度指數普遍高于單施化肥處理，香農指數、均勻度指數和優勢度指數無顯著差異。有機肥對土壤肥力和微生物群落結構影響顯著，但目前的研究多集中于不同施肥方式，如有機肥化肥配施和單施化肥對土壤微生物群落結構的影響，而針對有機肥不同施肥量和菜地施用有機肥微生物群落結構變化的報道較少。

畜禽糞便中含有豐富的有機質和氮磷等營養元素，經過堆肥處理的畜禽糞便施用于土壤，可以減少養殖廢棄物的排放，實現資源化利用，同時可替代化肥的使用，改善地力。雞的消化道較短，對飼料消化率低，導致大量營養物質隨糞便排出[11]，雞糞中氮、磷、鉀含量相對較高，分別為1.63%、1.54% 和0.85%[12]，因此雞糞作為有機肥主要原料之一，被廣泛應用于農業生產當中。本研究通過大田試驗，采用PLFA 技術探討雞糞有機肥不同施用水平下，土壤化學特性和微生物群落結構的變化規律，旨在明確不同施肥量對土壤微生物群落結構的影響，以期為科學養田、提高菜地土壤生物學質量、確定有機肥合理施用量提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗地點位于天津市東麗區露天菜地，該地土壤類型為潮土，基本化學特征為：pH 8.19，有機質28.23 g·kg-1，陽離子交換量33.63 cmol·kg-1，全氮0.83 g·kg-1，全磷0.94 g·kg-1，全鉀14.61 g·kg-1，銨態氮11.56 mg·kg-1，硝態氮100.35 mg·kg-1，有效磷117.58 mg·kg-1。雞糞有機肥購自天津市中埴盛華農業科技有限公司，其基礎化學特性為：pH 8.39，有機質345.50 g·kg-1，全氮21.56 g·kg-1，全磷20.18 g·kg-1，全鉀15.8 g·kg-1。

1.2 試驗設計與樣品采集

試驗設置5 個雞糞施用量，分別為0、7.5、15、30、60 t·hm-2，分別記為CK（不施肥）、T0.5（極低量有機肥）、T1（低量有機肥）、T2（中量有機肥）和T4（高量有機肥），其中T2 為常規施肥量處理。每個處理3 次重復，共15 個小區，每個小區面積10 m2，各小區隨機分組排列并用田埂隔開，小區內種植小油菜，品種為當地廣泛種植的寒綠（Brassica chinenesis cv.Hanlv）。采用人工撒施的方法將有機肥于2017 年4 月15 日一次性均勻施入小區內，翻耕，混勻（深度20 cm），澆水。小油菜共種植3 茬，每茬油菜種植周期為40 d，每10 d 左右灌一次水，使田間持水量保持在60%～80%。小油菜生長期間不再施用其他肥料，定期除草，按照田間常規管理方式進行管理。第3 茬小油菜收獲后，采用多點混合采樣的方法采集各小區0～20 cm土層土壤樣品，一部分土壤樣品于-20 ℃冷凍保存，用于土壤PLFA 的測定，另一部分土樣在室內自然風干，去除雜物和植物的殘體，研磨，過篩，用于土壤化學特性的測定。

1.3 土壤基本化學特征分析方法

土壤pH 按照1∶2.5 固液比浸提，濾液使用pH 計（NY/T 1377—2007）測定；土壤有機質采用重鉻酸鉀容量法（NY/T 1121.6—2006）測定；土壤陽離子交換量采用一次性平衡法測定；全氮采用自動定氮儀測定（NY / T 1121.24—2012）；銨態氮、硝態氮采用0.01 mol·L-1的CaCl2浸提，使用連續流動分析儀測定；全磷采用NaOH 熔融-鉬銻抗比色法測定；有效磷采用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提劑浸提，使用紫外分光光度計測定；土壤全鉀采用NaOH 熔融-原子吸收分光光度法測定。

1.4 土壤磷脂脂肪酸（PLFA）生物標記分析方法

磷脂脂肪酸（PLFA）的測定參照Bossio 等[13]的方法并進行改進。取凍干土樣8.0 g，將土壤進行兩次浸提與分離，然后依次進行萃取磷脂、酯化，以十九烷酸甲酯（C19∶00）為內標，所得樣品在氣相色譜儀（Agilent 7890B）上采用美國MIDI 公司生產的微生物自動鑒定系統（MIDI Sherlock）進行磷脂脂肪酸鑒定，每種磷脂脂肪酸的定量通過樣品中的內標（C19∶00）來表達[14]。土壤微生物的磷脂脂肪酸的表征參照文獻[15-17]，通過分析不同處理土壤特征磷脂脂肪酸的變化，來揭示土壤微生物群落組成及結構的變化，并以PLFA 數據為依據，通過計算不同施肥處理的Simpson 指數[18]、Shannon 指數[18]和Pielou 指數[19]，分析土壤微生物的多樣性、豐富度和均勻度的變化情況。

1.5 統計分析

實驗數據利用Excel 2013 進行整理，采用DPS進行單因素方差分析及差異顯著性分析，Canoco 5.0 進行主成分分析和冗余分析，繪圖使用Origin 2018 軟件。

2 結果與分析

2.1 土壤基本化學特征

土壤基本化學性質如表1 所示。 土壤pH 為7.80～8.26，呈弱堿性，與CK 相比，施用極低和低量（T0.5 和T1）雞糞有機肥提高了土壤pH，但未達到顯著水平（P＞0.05），中量和高量（T2 和T4）顯著降低了土壤pH（P＜0.05）。與不施肥相比，施用有機肥可以提高菜地土壤有機質（7.0%～34.1%）、CEC（5.8%～13.5%）、全氮（9.6%～48.2%）、全磷（10.6%～47.9%）、全鉀（7.4%～35.5%）、銨態氮（8.7%～46.1%）、硝態氮（1.2%～3.9%）和有效磷（2.9%～14.7%）的含量，其中有機質、全磷、全鉀、硝態氮和有效磷的含量隨著有機肥施用量的增加而增大，且各處理有機質、全磷和全鉀的含量均顯著高于CK（P＜0.05）。

2.2 土壤微生物群落結構多樣性

2.2.1 磷脂脂肪酸含量變化

有機肥不同施用量對土壤微生物PLFA 的影響各不相同（表2），土壤總PLFA、革蘭氏陰性菌（G-）、革蘭氏陽性菌（G+）、細菌和真菌的PLFA 變化趨勢基本一致，PLFA 含量表現為在極低量和低量施肥處理（T0.5 和T1）下有所抑制，降低幅度分別為9.1%～11.7%、10.4%～18.9%、5.0%～6.5%、8.6%～13.1% 和5.3%～7.7%，且除真菌外，其他較對照組均顯著降低（P＜0.05）；而在中、高劑量有機肥處理（T2 和T4）下，PLFA 含量均有所上升，且在T4 處理時顯著升高并達到最大值，與CK 相比，最高增幅分別為53.4%、65.5%、52.9%、52.1%和108.3%。

前人研究發現G-PLFA/G+PLFA 和真菌PLFA/細菌PLFA 的比值可作為研究微生物群落結構變化的指標[20]。投加雞糞有機肥后真菌PLFA/細菌PLFA 的比值均有所提高，且T2 和T4 處理顯著高于CK（P＜0.05），其中T4 處理比值最高。說明隨著施肥量的增加，土壤真菌與細菌的構成發生了顯著變化，真菌的占比增大，細菌反之。G+PLFA/G-PLFA 的比值范圍為0.83～1.04，T0.5處理比值最高，而T4處理比值最低。除T0.5和T1處理外，其他處理的G+PLFA/G-PLFA比值均低于對照，且隨施肥量的增加而降低，并在T4處理達到顯著水平（P＜0.05），說明有機肥不同施用量明顯改變了土壤細菌結構。

表1 土壤主要化學參數Table 1 Main chemical parameters of soil

表2 土壤磷脂脂肪酸含量特征Table 2 Content of phospholipid fatty acid（PLFA）in soils

由圖1 可知，細菌為各處理土壤的優勢微生物，其PLFA含量占微生物PLFA總量的75.6%～77.2%，細菌類群中，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌所占的比重較高，分別為25.5%～30.1% 和23.2%～26.6%，革蘭氏陰性菌在CK、T1、T2和T4處理中為優勢菌群，占比分別為27.9%、27.5%、26.0% 和30.1%；而在T0.5 處理中則以革蘭氏陽性菌為主，其占比為26.6%；兩種菌群對不同施肥處理的響應結果不同。除細菌外，真菌的總PLFA 含量占比較高，為3.6%～5.2%，且占比隨施肥量的增加而升高（除T0.5 處理外）。厭氧菌和真核生物PLFA含量占比則相對較少。

圖1 施用雞糞有機肥對土壤微生物PLFA占比的影響Figure 1 The ratio of microbes PLFA under different treatments of organic fertilizer from chicken excrement

2.2.2 生態學指數特征分析

Shannon 指數表征微生物群落物種組成的多樣性[21-22]，其值越大，說明微生物物種的多樣性越高。Simpson 指數表征群落中最常見物種的優勢度[23-24]。Pielou 指數反映群落中物種的均勻度[23-24]。土壤微生物群落多樣性的分析結果（表3）表明，施用有機肥處理的Simpson 指數、Shannon 指數和Pielou 指數較對照組均有不同程度的增加，其中Simpson 指數的最大值出現在T2 處理，為0.790，顯著高于CK（P＜0.05），CK處理的值最小，為0.782；Shannon 指數和Pielou 指數值較高的是T2 和T4 處理，均顯著高于CK（P＜0.05），并在T2時取到最大值。說明施用有機肥增加了土壤微生物的多樣性，施肥量≥30 t·hm-2時，對土壤微生物多樣性的影響較大。

2.2.3 土壤微生物群落主成分分析

不同處理的土壤磷脂脂肪酸主成分分析結果（圖2）表明，第一主成分軸和第二主成分軸對不同施肥處理的差異貢獻率分別為90.4%和4.6%，其累計貢獻率達到95.0%。各處理中，CK、T0.5、T1 最為接近，均位于第三象限，說明以上3 個處理微生物群落組成較為相似；而T2 和T4 分別位于第一象限和第四象限，表明T2 和T4 處理的微生物群落結構發生了較大的變化，且與CK、T0.5、T1處理差異顯著。T2和T4處理與各類群微生物箭頭指向基本一致，呈銳角，說明該施肥處理與微生物的PLFA 含量相關性較強，而CK、T0.5、T1處理與箭頭方向相反，呈鈍角，說明其相關性較弱。以上結果表明，施肥改變了土壤原有微生物群落的組成和結構，尤其是在有機肥施用量為30 t·hm-2和60 t·hm-2時對各類群微生物的影響較大。

表3 磷脂脂肪酸生物標記物生態學指數Table 3 Ecological index of phospholipid fatty acid biomarkers

圖2 不同施肥處理的土壤微生物特征磷脂脂肪酸主成分分析Figure 2 Principal component analysis of phospholipid fatty acids in soil microbial characteristics under different fertilization treatments

2.2.4 土壤微生物與環境因子的RDA分析

為解釋引起土壤中微生物群落結構變化的主要環境因子，對各類群微生物PLFA 含量與土壤化學特征進行冗余分析（Redundant analysis，RDA）（圖3）。首先對微生物群落的PLFA值進行除趨勢對應（DCA）分析，結果表明其4個排序軸的長度均小于3，因此選用RDA 進行分析。利用Canoco 5.0 軟件對影響土壤微生物群落結構變化的土壤基礎化學性質等環境因子進行蒙特卡羅檢驗。有機質和全鉀的膨脹因子（F）均大于20，與其他環境因子具有多重共線性，因此去除以上兩個因子。篩選結束后選擇CEC（F=2.6，P=0.110）、全氮（F=0.2，P=0.764）、全磷（F=3.6，P=0.076）、硝態氮（F=13，P=0.004）、銨態氮（F=0.6，P=0.468）、有 效 磷（F=3.9，P=0.070）、pH（F=6.3，P=0.034）幾個環境因子進行冗余分析。由圖4 可知，兩個排序軸對物種變量的解釋度達87.2%，其中第一、第二排序軸分別解釋了微生物群落變化的83.3% 和3.9%。 硝態氮和pH 分別占總解釋度的50.0% 和11.9%，是對微生物結構變異影響較大的兩個環境因子，其次是總磷（10.1%）、CEC（8.9%）和有效磷（5.7%），銨態氮和全氮所占的比例較小，分別為0.9%和0.3%。由環境因子與微生物PLFA 箭頭的夾角可知，CEC、pH 與各微生物PLFA 表現為負相關，有效磷、銨態氮、硝態氮、全氮、全磷與各菌群PLFA 呈正相關。

圖3 土壤微生物群落特征與環境因子的RDA排序圖Figure 3 RDA ordination diagram of microbial communities characteristics and environmental factors of soil

3 討論

施用有機肥可提高土壤肥力，改善土壤環境條件。胡誠等[25]研究發現，隨著有機肥施用量的增加，土壤pH 降低，逐漸接近中性。本研究中，土壤pH 在施肥量小于30 t·hm-2時與不施肥相比無顯著變化，施肥量為30 t·hm-2和60 t·hm-2時，pH 低于不施肥處理，原因可能是大量施入有機肥使得土壤硝化作用增強，產生了大量的H+，從而降低了土壤的pH[26]。宇萬太等[27]研究發現，施用有機肥能顯著提高土壤中全磷和全鉀含量，且高量有機肥處理增加幅度明顯高于低量施肥處理，這與本研究結果相一致。宋蒙亞等[20]發現，菜地土壤有效態養分含量增加的直接原因可能是大量施用有機肥后土壤的氮磷等營養物質得到了有效的補充，這也可能是本研究中土壤銨態氮、硝態氮和有效磷含量隨著施肥量的增加不斷累積，且在施肥量較高時明顯增加的原因。弓萌萌等[28]研究發現，土壤有機質含量隨有機肥施用量的增加而增大，其主要原因是有機肥中有機質含量豐富，在本研究中，有機質的變化規律與上述結果一致，且施用雞糞有機肥后有機質含量顯著升高。

微生物是土壤生態環境中重要的組成部分，對土壤環境的變化極其敏感[29]。施肥后土壤中微生物的量會發生明顯變化，表現為顯著增加[30]。本研究中，微生物總PLFA 的含量在施用較低劑量有機肥料（≤15 t·hm-2）時低于CK，而中、高劑量（≥30 t·hm-2）施肥處理則高于CK，此外，G-、G+、真菌和細菌PLFA 含量的變化規律與總PLFA 基本一致。有機肥施用量較大時，土壤細菌和真菌均有所增加，其中真菌增長幅度相對較大，但細菌在微生物類群中仍占據絕對優勢。大量有機肥提供的養分滿足了土壤中微生物代謝活動的需要[31]，同時緩解了土壤不適宜的酸堿度對微生物的影響[32]；此外，施肥量較高時向土壤中輸入了大量的外源微生物，在一定程度上起到了“接種”的作用[33-34]。土壤微生物的生態學指數均明顯高于不施肥處理，這與夏昕等[35]的研究結果一致，施肥量為30 t·hm-2時，土壤微生物的生態學指數最高，說明施用有機肥會增加土壤微生物群落的多樣性，使土壤微生物的量及群落構成發生變化。施加高量有機肥（60 t·hm-2）時，土壤微生物群落的多樣性、豐富度和均勻度較常規施肥量雖有所降低，但Shannon 指數和Pielou指數的降低幅度較小，均未達到顯著水平。

真菌PLFA/細菌PLFA 的值可反映土壤真菌與細菌的結構比例、土壤生態系統穩定性及健康程度，且比值越高越穩定[36]。施用有機肥后，土壤真菌與細菌的磷脂脂肪酸比值均有所升高，中量和高量有機肥處理顯著高于不施肥處理，這與裴雪霞等[37]的研究結果一致，該結果說明施肥改變了真菌與細菌的比例結構，施用有機肥的土壤生態系統的穩定性優于不施肥處理，且施肥量≥30 t·hm-2時更有利于生態系統的穩定性，其原因可能是真菌可通過菌絲移動來分解外來營養物質，且對碳源的同化效率高，而細菌則不具備此優勢[35]。施用有機肥為土壤提供了外來碳源，有利于真菌的生長繁殖，且施肥量較大時，真菌比細菌更占據優勢。G+PLFA/G-PLFA的比值可表征土壤的營養狀況，比值越低營養狀況越好[38]。本研究結果表明，隨著有機肥投入量的增加，革蘭氏陰性菌的相對豐度高于革蘭氏陽性菌，且G+PLFA/G-PLFA 的比值呈降低趨勢，說明隨著有機肥施用量的增加，土壤所受的營養脅迫降低，由表1 可知，施肥量較高時土壤營養狀況明顯改善。

主成分分析（圖2）將不同施肥量處理明顯區分開來，分為不施肥處理和較低劑量有機肥處理、中量有機肥處理、高量有機肥處理3 部分，這表明施肥量對土壤微生物的結構影響顯著，且施肥量≥30 t·hm-2時微生物群落結構開始發生轉變。土壤微生物群落結構受到土壤理化性質的影響，因此微生物群落結構的改變也可能是由于不同施肥處理的土壤環境中理化性質的差異造成不同處理間微生物的生長、繁殖與富集不盡相同[39]。牛佳等[40]研究發現，土壤中的碳、氮含量是土壤微生物生長的主要限制因素。Bekku等[41]認為土壤有機質和全氮可能是影響土壤微生物生長的主要因素。在本研究中，硝態氮（50%）、pH（11.9%）和總磷（10.1%）對群落結構改變的解釋度最大，硝態氮和總磷是土壤養分的重要組成部分，說明施用有機肥主要是通過改變土壤氮磷的養分水平及土壤的酸堿度，從而對土壤微生物群落結構產生影響，這與章家恩等[42]和孫瑞蓮等[43]的研究結果相一致。CEC和pH與各微生物PLFA的量表現為負相關，這可能是造成施肥量較低時，土壤微生物PLFA 含量降低的原因。張蓉等[44]以復墾多年的林地和草地為研究對象，發現CEC 與土壤微生物PLFA 含量呈正相關，與本試驗研究結果相反，這可能與研究區域土壤本身性質、土壤利用方式及氣候因素等的差異有關，其具體原因還有待進一步驗證。

4 結論

（1）施加雞糞有機肥有效地改變了土壤的化學性質，提高了土壤肥力。在極低量有機肥處理下土壤銨態氮、硝態氮和有效磷含量未明顯增加；而不同施肥水平下，土壤CEC、有機質、全氮、全磷和全鉀含量均顯著增加。

（2）中量和高量有機肥處理促進了土壤微生物PLFA含量的增加，土壤微生物生態指數的增長，明顯提高了真菌與細菌磷脂脂肪酸的比值。

（3）施加雞糞有機肥有效地改變了土壤微生物的群落結構，且施加中量和高量有機肥處理（≥30 t·hm-2）土壤微生物群落結構顯著區別于不施肥和較低劑量有機肥處理（≤15 t·hm-2），驅動土壤微生物群落組成發生變化的主要因素為硝態氮、全磷和pH。